Sohn, Jae-Hak;Park, Sun Jung;Seo, Changon;Chun, Bokyung;Oh, Hyuncheol
한국해양바이오학회지
/
제2권4호
/
pp.230-233
/
2007
Protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) acts as a negative regulator of insulin signaling, and selective inhibition of PTP1B has served as a potential drug target for the treatment of type 2 diabetes. As part of our searching for PTP1B inhibitors from natural products, the extracts of marine microorganisms were screened for the inhibitory effects on the activity of protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B). Among the tested 304 extracts, 29 extracts exhibited inhibition rate ranging 40.1 - 83.6 % against PTP1B at the concentration level of $30{\mu}g/mL$.
The dephosphorylation specificity of protein phosphatase 2A (PP2A), calcineurin (PP2B) and protein phosphatase 2C (PP2C) were studied in vitro using myelin basic protein (MBP) as a model substrate which was fully phosphorylated at multiple sites by protein kinase C (PKC) or cyclic AMP-dependent protein kinase (PKA). In order to determine the site specificity of phosphates in myelin basic protein, the protein was digested with trypsin and the radioactive phosphopeptide fragments were isolated by high performance liquid chromatography (HPLC) on reversed-phase column. Subsequent analysis and/or sequential manual Edman degradation of the purified phosphopeptides revealed that Thr-65 and Ser-115 were most extensively phophorylated by PKA and Ser-55 by PKC. For the dephosphorylation kinetics, the phosphorylated MBP was treated with calcineurin or PP2C with various time intervals and the reaction was terminated by direct tryptic digest. Both Thr-65 and Ser-115 residues were dephosphorylated more rapidly than any other ones by phosphatases. However it can be differentiated further by first-order kinetics that the PP2B dephosphorylated both Thr-65 and Ser-115 with almost same manner, whereas PP2C dephosphorylated somewhat preferentially the Ser-115.
The Drosophila genome contains four low molecular weight-protein tyrosine phosphatase (LMW-PTP) members: Primo-1, Primo-2, CG14297, and CG31469. The lack of intensive biochemical analysis has limited our understanding of these proteins. Primo-1 and CG31469 were previously classified as pseudophosphatases, but CG31469 was also suggested to be a putative protein arginine phosphatase. Herein, we present the crystal structures of CG31469 and Primo-1, which are the first Drosophila LMW-PTP structures. Structural analysis showed that the two proteins adopt the typical LMW-PTP fold and have a canonically arranged P-loop. Intriguingly, while Primo-1 is presumed to be a canonical LMW-PTP, CG31469 is unique as it contains a threonine residue at the fifth position of the P-loop motif instead of highly conserved isoleucine and a characteristically narrow active site pocket, which should facilitate the accommodation of phosphoarginine. Subsequent biochemical analysis revealed that Primo-1 and CG31469 are enzymatically active on phosphotyrosine and phosphoarginine, respectively, refuting their classification as pseudophosphatases. Collectively, we provide structural and biochemical data on two Drosophila proteins: Primo-1, the canonical LMW-PTP protein, and CG31469, the first investigated eukaryotic protein arginine phosphatase. We named CG31469 as DARP, which stands for Drosophila ARginine Phosphatase.
Azad, Md. Abul Kalam;Sawa, Yoshihiro;Ishikawa, Takahiro;Shibata, Hitoshi
BMB Reports
/
제39권6호
/
pp.671-676
/
2006
The holoenzyme of protein phosphatase (PP) from tulip petals was purified by using hydrophobic interaction, anion exchange and microcystin affinity chromatography to analyze activity towards p-nitrophenyl phosphate (p-NPP). The catalytic subunit of PP was released from its endogenous regulatory subunits by ethanol precipitation and further purified. Both preparations were characterized by immunological and biochemical approaches to be PP2A. On SDS-PAGE, the final purified holoenzyme preparation showed three protein bands estimated at 38, 65, and 75 kDa while the free catalytic subunit preparation showed only the 38 kDa protein. In both preparations, the 38 kDa protein was identified immunologically as the catalytic subunit of PP2A by using a monoclonal antibody against the PP2A catalytic subunit. The final 623- and 748-fold purified holoenzyme and the free catalytic preparations, respectively, exhibited high sensitivity to inhibition by 1 nM okadaic acid when activity was measured with p-NPP. The holoenzyme displayed higher stimulation in the presence of ammonium sulfate than the free catalytic subunit did by protamine, thereby suggesting different enzymatic behaviors.
Protein phosphatase 2C (PP2C) is one of the four major serine/threonine phosphatases which is dependent on $Mg^{2+}$ for its activity. PP2C was purified from rat liver cytosol and its characteristics were investigated. The substrate employed for routine assay was $[^{32}P]casein$ phosphorylated by PKA. The purification process involved DEAE chromatography, ammonium sulfate fractionation, phenyl sepharose chromatography, sephacryl 5-200 gel filtration, and histone agarose chromatography. The SDS-PAGE of PP2C showed one major single protein band at a position corresponding to a molecular mass of 43 kd and the purification fold was 637. The enzyme showed a pH optimum of 8 and $K_M$ value was $1.9\;{\mu}M$. However, when the substrate was changed to $[^{32}P]histone$, the pH optimum was shifted to 7 and $K_M$ value was $2.3\;{\mu}M.\;Mg^{2+}$ was essential to the enzyme activity and okadaic acid did not exert any inhibitory effect on the enzyme. To examine residue in the active site of PP2C effects of some protein-modifying reagents were tested.
Kim, Hong Seok;Kang, Yun Hee;Lee, Jisu;Han, Seung Ro;Kim, Da Bin;Ko, Haeun;Park, Seyoun;Lee, Myung-Shin
Molecules and Cells
/
제44권10호
/
pp.710-722
/
2021
Hypoxia, or low oxygen tension, is a hallmark of the tumor microenvironment. The hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) subunit plays a critical role in the adaptive cellular response of hypoxic tumor cells to low oxygen tension by activating gene-expression programs that control cancer cell metabolism, angiogenesis, and therapy resistance. Phosphorylation is involved in the stabilization and regulation of HIF-1α transcriptional activity. HIF-1α is activated by several factors, including the mitogen-activated protein kinase (MAPK) superfamily. MAPK phosphatase 3 (MKP-3) is a cytoplasmic dual-specificity phosphatase specific for extracellular signal-regulated kinase 1/2 (Erk1/2). Recent evidence indicates that hypoxia increases the endogenous levels of both MKP-3 mRNA and protein. However, its role in the response of cells to hypoxia is poorly understood. Herein, we demonstrated that small-interfering RNA (siRNA)-mediated knockdown of MKP-3 enhanced HIF-1α (not HIF-2α) levels. Conversely, MKP-3 overexpression suppressed HIF-1α (not HIF-2α) levels, as well as the expression levels of hypoxia-responsive genes (LDHA, CA9, GLUT-1, and VEGF), in hypoxic colon cancer cells. These findings indicated that MKP-3, induced by HIF-1α in hypoxia, negatively regulates HIF-1α protein levels and hypoxia-responsive genes. However, we also found that long-term hypoxia (>12 h) induced proteasomal degradation of MKP-3 in a lactic acid-dependent manner. Taken together, MKP-3 expression is modulated by the hypoxic conditions prevailing in colon cancer, and plays a role in cellular adaptation to tumor hypoxia and tumor progression. Thus, MKP-3 may serve as a potential therapeutic target for colon cancer treatment.
The regulation of protein tyrosine phosphorylation is mediated by protein tyrosine kinases (PTKs) and protein tyrosine phosphatases (PTPs) and is essential for cellular homeostasis. Co-expression of PTKs with PTPs in Pichia pastoris was used to facilitate the expression of active PTKs by neutralizing their apparent toxicity to cells. In this study, the gene encoding phosphatase PTP1B with or without a blue fluorescent protein or peroxisomal targeting signal 1 was cloned into the expression vector pAG32 to produce four vectors. These vectors were subsequently transformed into P. pastoris GS115. The tyrosine kinases EGFR-2 and $PDGFR{\beta}$ were expressed from vector pPIC3.5K and were fused with a His-tag and green fluorescent protein at the N-terminus. The two plasmids were transformed into P. pastoris with or without PTP1B, resulting in 10 strains. The EGFR-2 and $PDGFR{\beta}$ fusion proteins were purified by $Ni^{2+}$ affinity chromatography. In the recombinant P. pastoris, the PTKs co-expressed with PTP1B exhibited higher kinase catalytic activity than did those expressing the PTKs alone. The highest activities were achieved by targeting the PTKs and PTP1B into peroxisomes. Therefore, the EGFR-2 and $PDGFR{\beta}$ fusion proteins expressed in P. pastoris may be attractive drug screening targets for anticancer therapeutics.
신경수초 염기성 단백질(MBP)에 대한 탈인산화의 자리 특이성에 대한 연구를 시험관에서 수행하였다. MBP에서 인산화된 자리를 알아내기 위해서 MBP를 단백질 키나제 C로 인산화 시키고 단백질 탈인산화 효소 PP2A로 탈인산화시켰다. 인산화된 MBP는 트립신으로 잘라내어서 역상 HPLC 크로마토그래피로 펩티드 조각들을 분리하였다. 각 조각들을 섬광 계측한 후 일부 펩티드의 아미노산 서열을 결정하였다. 일곱 개의 방사능을 보이는 펩티드 조각이 검출되었으며 두번째 조각($P_2$)의 $Ser^{55}$에 해당하는 아미노산이 인산화 반응에 가장 큰 민감도를 보였다. 그러나 탈인산화는 다섯번째 고작($P_5$)의 인산이 가장 잘 방출되는 것으로 나타났다. 이 결과는 MBP가 단백질 탈인산화 반응에 적절한 기질임을 보여주고 있다.
Protein phosphatase 2A (PP2A), a family of serine/threonine protein phosphatases, plays an important role in balancing the phosphorylation status of cellular proteins for regulating diverse biological functions in eukaryotic organisms. Despite intensive studies in mammals, limited information on its role is available in filamentous fungi. Here, we investigated the functional roles of genes for a putative B' delta regulatory subunit (FgPP2AR) and a catalytic subunit (FgPP2AC) of PP2A in a filamentous ascomycete, Fusarium graminearum. Molecular characterization of an insertional mutant of this plant pathogenic fungus allowed us to identify the roles of FgPP2AR. Targeted gene replacement and complementation analyses demonstrated that the deletion of FgPP2AR, which was constitutively expressed in all growth stages, caused drastic changes in hyphal growth, conidia morphology/germination, gene expression for mycotoxin production, sexual development and pathogenicity. In particular, overproduction of aberrant cylindrical-shaped conidia is suggestive of arthroconidial induction in the ${\Delta}FgPP2AR$ strain, which has never been described in F. graminearum. In contrast, the ${\Delta}FgPP2AC$ strain was not significantly different from its wild-type progenitor in conidiation, trichothecene gene expression, and pathogenicity; however, it showed reduced hyphal growth and no perithecial formation. The double-deletion ${\Delta}FgPP2AR;{\Delta}FgPP2AC$ strain had more severe defects than single-deletion strains in all examined phenotypes. Taken together, our results indicate that both the putative regulatory and catalytic subunits of PP2A are involved in various cellular processes for fungal development in F. graminearum.
본 웹사이트에 게시된 이메일 주소가 전자우편 수집 프로그램이나
그 밖의 기술적 장치를 이용하여 무단으로 수집되는 것을 거부하며,
이를 위반시 정보통신망법에 의해 형사 처벌됨을 유념하시기 바랍니다.
[게시일 2004년 10월 1일]
이용약관
제 1 장 총칙
제 1 조 (목적)
이 이용약관은 KoreaScience 홈페이지(이하 “당 사이트”)에서 제공하는 인터넷 서비스(이하 '서비스')의 가입조건 및 이용에 관한 제반 사항과 기타 필요한 사항을 구체적으로 규정함을 목적으로 합니다.
제 2 조 (용어의 정의)
① "이용자"라 함은 당 사이트에 접속하여 이 약관에 따라 당 사이트가 제공하는 서비스를 받는 회원 및 비회원을
말합니다.
② "회원"이라 함은 서비스를 이용하기 위하여 당 사이트에 개인정보를 제공하여 아이디(ID)와 비밀번호를 부여
받은 자를 말합니다.
③ "회원 아이디(ID)"라 함은 회원의 식별 및 서비스 이용을 위하여 자신이 선정한 문자 및 숫자의 조합을
말합니다.
④ "비밀번호(패스워드)"라 함은 회원이 자신의 비밀보호를 위하여 선정한 문자 및 숫자의 조합을 말합니다.
제 3 조 (이용약관의 효력 및 변경)
① 이 약관은 당 사이트에 게시하거나 기타의 방법으로 회원에게 공지함으로써 효력이 발생합니다.
② 당 사이트는 이 약관을 개정할 경우에 적용일자 및 개정사유를 명시하여 현행 약관과 함께 당 사이트의
초기화면에 그 적용일자 7일 이전부터 적용일자 전일까지 공지합니다. 다만, 회원에게 불리하게 약관내용을
변경하는 경우에는 최소한 30일 이상의 사전 유예기간을 두고 공지합니다. 이 경우 당 사이트는 개정 전
내용과 개정 후 내용을 명확하게 비교하여 이용자가 알기 쉽도록 표시합니다.
제 4 조(약관 외 준칙)
① 이 약관은 당 사이트가 제공하는 서비스에 관한 이용안내와 함께 적용됩니다.
② 이 약관에 명시되지 아니한 사항은 관계법령의 규정이 적용됩니다.
제 2 장 이용계약의 체결
제 5 조 (이용계약의 성립 등)
① 이용계약은 이용고객이 당 사이트가 정한 약관에 「동의합니다」를 선택하고, 당 사이트가 정한
온라인신청양식을 작성하여 서비스 이용을 신청한 후, 당 사이트가 이를 승낙함으로써 성립합니다.
② 제1항의 승낙은 당 사이트가 제공하는 과학기술정보검색, 맞춤정보, 서지정보 등 다른 서비스의 이용승낙을
포함합니다.
제 6 조 (회원가입)
서비스를 이용하고자 하는 고객은 당 사이트에서 정한 회원가입양식에 개인정보를 기재하여 가입을 하여야 합니다.
제 7 조 (개인정보의 보호 및 사용)
당 사이트는 관계법령이 정하는 바에 따라 회원 등록정보를 포함한 회원의 개인정보를 보호하기 위해 노력합니다. 회원 개인정보의 보호 및 사용에 대해서는 관련법령 및 당 사이트의 개인정보 보호정책이 적용됩니다.
제 8 조 (이용 신청의 승낙과 제한)
① 당 사이트는 제6조의 규정에 의한 이용신청고객에 대하여 서비스 이용을 승낙합니다.
② 당 사이트는 아래사항에 해당하는 경우에 대해서 승낙하지 아니 합니다.
- 이용계약 신청서의 내용을 허위로 기재한 경우
- 기타 규정한 제반사항을 위반하며 신청하는 경우
제 9 조 (회원 ID 부여 및 변경 등)
① 당 사이트는 이용고객에 대하여 약관에 정하는 바에 따라 자신이 선정한 회원 ID를 부여합니다.
② 회원 ID는 원칙적으로 변경이 불가하며 부득이한 사유로 인하여 변경 하고자 하는 경우에는 해당 ID를
해지하고 재가입해야 합니다.
③ 기타 회원 개인정보 관리 및 변경 등에 관한 사항은 서비스별 안내에 정하는 바에 의합니다.
제 3 장 계약 당사자의 의무
제 10 조 (KISTI의 의무)
① 당 사이트는 이용고객이 희망한 서비스 제공 개시일에 특별한 사정이 없는 한 서비스를 이용할 수 있도록
하여야 합니다.
② 당 사이트는 개인정보 보호를 위해 보안시스템을 구축하며 개인정보 보호정책을 공시하고 준수합니다.
③ 당 사이트는 회원으로부터 제기되는 의견이나 불만이 정당하다고 객관적으로 인정될 경우에는 적절한 절차를
거쳐 즉시 처리하여야 합니다. 다만, 즉시 처리가 곤란한 경우는 회원에게 그 사유와 처리일정을 통보하여야
합니다.
제 11 조 (회원의 의무)
① 이용자는 회원가입 신청 또는 회원정보 변경 시 실명으로 모든 사항을 사실에 근거하여 작성하여야 하며,
허위 또는 타인의 정보를 등록할 경우 일체의 권리를 주장할 수 없습니다.
② 당 사이트가 관계법령 및 개인정보 보호정책에 의거하여 그 책임을 지는 경우를 제외하고 회원에게 부여된
ID의 비밀번호 관리소홀, 부정사용에 의하여 발생하는 모든 결과에 대한 책임은 회원에게 있습니다.
③ 회원은 당 사이트 및 제 3자의 지적 재산권을 침해해서는 안 됩니다.
제 4 장 서비스의 이용
제 12 조 (서비스 이용 시간)
① 서비스 이용은 당 사이트의 업무상 또는 기술상 특별한 지장이 없는 한 연중무휴, 1일 24시간 운영을
원칙으로 합니다. 단, 당 사이트는 시스템 정기점검, 증설 및 교체를 위해 당 사이트가 정한 날이나 시간에
서비스를 일시 중단할 수 있으며, 예정되어 있는 작업으로 인한 서비스 일시중단은 당 사이트 홈페이지를
통해 사전에 공지합니다.
② 당 사이트는 서비스를 특정범위로 분할하여 각 범위별로 이용가능시간을 별도로 지정할 수 있습니다. 다만
이 경우 그 내용을 공지합니다.
제 13 조 (홈페이지 저작권)
① NDSL에서 제공하는 모든 저작물의 저작권은 원저작자에게 있으며, KISTI는 복제/배포/전송권을 확보하고
있습니다.
② NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 상업적 및 기타 영리목적으로 복제/배포/전송할 경우 사전에 KISTI의 허락을
받아야 합니다.
③ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 보도, 비평, 교육, 연구 등을 위하여 정당한 범위 안에서 공정한 관행에
합치되게 인용할 수 있습니다.
④ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 무단 복제, 전송, 배포 기타 저작권법에 위반되는 방법으로 이용할 경우
저작권법 제136조에 따라 5년 이하의 징역 또는 5천만 원 이하의 벌금에 처해질 수 있습니다.
제 14 조 (유료서비스)
① 당 사이트 및 협력기관이 정한 유료서비스(원문복사 등)는 별도로 정해진 바에 따르며, 변경사항은 시행 전에
당 사이트 홈페이지를 통하여 회원에게 공지합니다.
② 유료서비스를 이용하려는 회원은 정해진 요금체계에 따라 요금을 납부해야 합니다.
제 5 장 계약 해지 및 이용 제한
제 15 조 (계약 해지)
회원이 이용계약을 해지하고자 하는 때에는 [가입해지] 메뉴를 이용해 직접 해지해야 합니다.
제 16 조 (서비스 이용제한)
① 당 사이트는 회원이 서비스 이용내용에 있어서 본 약관 제 11조 내용을 위반하거나, 다음 각 호에 해당하는
경우 서비스 이용을 제한할 수 있습니다.
- 2년 이상 서비스를 이용한 적이 없는 경우
- 기타 정상적인 서비스 운영에 방해가 될 경우
② 상기 이용제한 규정에 따라 서비스를 이용하는 회원에게 서비스 이용에 대하여 별도 공지 없이 서비스 이용의
일시정지, 이용계약 해지 할 수 있습니다.
제 17 조 (전자우편주소 수집 금지)
회원은 전자우편주소 추출기 등을 이용하여 전자우편주소를 수집 또는 제3자에게 제공할 수 없습니다.
제 6 장 손해배상 및 기타사항
제 18 조 (손해배상)
당 사이트는 무료로 제공되는 서비스와 관련하여 회원에게 어떠한 손해가 발생하더라도 당 사이트가 고의 또는 과실로 인한 손해발생을 제외하고는 이에 대하여 책임을 부담하지 아니합니다.
제 19 조 (관할 법원)
서비스 이용으로 발생한 분쟁에 대해 소송이 제기되는 경우 민사 소송법상의 관할 법원에 제기합니다.
[부 칙]
1. (시행일) 이 약관은 2016년 9월 5일부터 적용되며, 종전 약관은 본 약관으로 대체되며, 개정된 약관의 적용일 이전 가입자도 개정된 약관의 적용을 받습니다.