• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제23권5호
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• pp.689-698
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• 2013

The production and characterization of an active recombinant N-acetylgalactosamine-6-sulfate sulfatase (GALNS) in Escherichia coli BL21(DE3) has been previously reported. In this study, the effect of the signal peptide (SP), inducer concentration, process scale, and operational mode (batch and semi-continuous) on GALNS production were evaluated. When native SP was presented, higher enzyme activity levels were observed in both soluble and inclusion bodies fractions, and its removal had a significant impact on enzyme activation. At shake scale, the optimal IPTG concentrations were 0.5 and 1.5 mM for the strains with and without SP, respectively, whereas at bench scale, the highest enzyme activities were observed with 1.5 mM IPTG for both strains. Noteworthy, enzyme activity in the culture media was only detected when SP was presented and the culture was carried out under semi-continuous mode. We showed for the first time that the mechanism that in prokaryotes recognizes the SP to mediate sulfatase activation can also recognize a eukaryotic SP, favoring the activation of the enzyme, and could also favor the secretion of the recombinant protein. These results offer significant information for scaling-up the production of human sulfatases in E. coli.

• 대한의생명과학회지
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• 제9권3호
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• pp.139-144
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• 2003

Since water borne infection causes acute diseases and results in spread of diseases by secondary infection, the prevention is very important. Therefore, it is necessary to have a method that is rapid and effective to monitor pathogenic bacteria in drinking water. In this study, we employed a systematic method, Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) analysis, to develop an effective monitoring system for possible bacterial contaminants in drinking water. For this purpose, PCR primers were derived from 992 bp region of the 16s rRNA gene that is highly conserved through the different species of prokaryotes. To test whether the PCR primers designed are indeed useful for detecting all the possible microbial contaminants in the water, the primers were used to amplify 16s rRNA regions of different microbial water-borne pathogens such as E. coli, Salmonella, Yersinia, Listeria, and Staphylococcus. As expected, all of tested microorganisms amplified expected size of PCR products indicating designed PCR primers for 16s rRNA indeed can be useful to amplify all different microbial water-borne pathogens in the water. Furthermore, to test whether these 16s rRNA based PCR primers can detect bacterial populations present in the water, water samples taken from diverse sources, such as river, tap, and sewage, were used for amplification. PCR products were for then subjected for cloning into a T-vector to generate a library containing 16s rRNA sequences from various bacteria. With cloned PCR products, RFLP analysis was done using PCR products digested with restriction enzyme such as Hae III to obtain species-specific RFLP profiles. After PCR-RFLP, the bacterial clones which showed the same RFLP profiles were regarded as the same ones, and the clones which showed distinctive RFLP profiles were subsequently subjected for sequence analysis for species identification. By this PCR-RFLP analysis, we were able to reveal diverse populations of bacteria living in water. In brief, in unsterilized natural river water, over 60 different species of bacteria were found. On the other hand, no PCR products were detected in drinking tap-water. The results from this study clearly indicate that the PCR-RFLP-sequence analysis can be a useful method for monitoring diverse, perhaps pathogenic bacteria contaminated in water in a rapid fashion.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제27권11호
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• pp.2044-2051
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• 2017

The main pathological hallmark of Alzheimer's disease is the deposition of amyloid-beta ($A{\beta}$) peptides in the brain. $A{\beta}$ has been widely used to mimic several aspects of Alzheimer's disease. However, several characteristics of amyloid-induced Alzheimer's disease pathology are not well established, especially in mice. The present study aimed to develop a new Alzheimer's disease model by investigating how $A{\beta}$ can be effectively aggregated using prokaryotes and eukaryotes. To express the $A{\beta}42$ complex in HEK293 cells, we cloned the $A{\beta}42$ region in a tandem repeat and incorporated the resulting construct into a eukaryotic expression vector. Following transfection into HEK293 cells via lipofection, cell viability assay and western blotting analysis revealed that exogenous $A{\beta}42$ can induce cell death and apoptosis. In addition, recombinant His-tagged $A{\beta}42$ was successfully expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) and not only readily formed $A{\beta}$ complexes, but also inhibited the proliferation of SH-SY5Y cells and E. coli. For in vivo testing, recombinant His-tagged $A{\beta}42$ solution ($3{\mu}g/{\mu}l$ in $1{\times}PBS$ containing $1mM\;Ni^{2+}$) was injected stereotaxically into the left and right lateral ventricles of the brains of C57BL/6J mice (n = 8). Control mice were injected with $1{\times}PBS$ containing $1mM\;Ni^{2+}$ following the same procedure. Ten days after the sample injection, the Morris water maze test confirmed that exogenous $A{\beta}$ caused an increase in memory loss. These findings demonstrated that $Ni^{2+}$ is capable of complexing the 50-kDa amyloid and that intracerebroventricular injection of $A{\beta}42$ can lead to cognitive impairment, thereby providing improved Alzheimer's disease models.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제33권2호
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• pp.84-89
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• 2005

Phosphomannomutase는 진핵 생물과 원핵 생물에 있어서 중요한 효소로, ${\alpha}$-D-mannose 6-phosphate를 ${\alpha}$-D-mannose 1-phosphate로 전환시켜 GDP-mannose를 생산한다. 이 기질은 여러 대사 경로에서 중요하게 작용하는 mannosyl기를 제공하도록 돕는다. 본 논문에서는 Sphingomonas chungbukensis DJ77에서 phosphomannomutase를 암호화하는 유전자를 유전체 library로부터 동정하고 이를 pmmC로 명명하였으며, 이를 발현 vector에 클로닝하고 염기서열을 분석하였다. 유전자 pmmC는 ATG를 개시 코돈으로 사용하고, TAG를 종결 코돈으로 사용하는 750 bp의 open reading frame임을 확인하였고, 이 ORF의 5 bp앞쪽으로 리보좀 결합 부위가 존재한다. 이 ORF로부터 유추되는 아미노산은 249개이며, 단백질 분자량은 약 27.4 kDa이다. 이 유전자를 구성하는 아미노산 서열은 NCBI의 conserved domain search를 통한 분석으로 eukaryotic phosphomannomutase와 약 $86.9\%$ 유사성이 있음을 나타냈고, 기질에 대한 활성을 측정한 결과 pmmC 유전자가 암호화하는 단백질이 phosphomannomutase임을 확인할 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제28권11호
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• pp.1379-1385
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• 2018

당사슬은 당단백질과 단백당에 결합하며, 일반적으로 세포의 최외각 표면에서 발견된다. O-연결 당사슬과 N-연결 당사슬은 진핵세포에 흔히 존재하는 당사슬이며 원핵세포에서도 발견된다. 세포 표면에 존재하는 당사슬과 주변에 동일한 종류의 세포막에 노출된 당사슬 결합 단백질과의 상호작용, 전혀 다른 종류의 세포와의 상호작용, 또는 질병 유발 균주와 바이러스와의 상호작용은 생물학 및 의생명과학에 있어서 질병원인물질 인식, 세포 이동, 세포간의 결합, 발생, 그리고 감염 등과 같은 과정에 있어서 매우 중요한 역할을 담당한다. 각종 질병 상황에서의 당사슬의 프로파일의 변화와 역할은 당사슬이 질병 진단 마커로 활용할 가능성을 제시한다. 이에 더하여, 기존의 많은 선행 연구들에서, 재조합 단백질 의약품에 결합된 당사슬은 재조합 단백질 의약품의 용해도, 약동역학, 약물 활성, 생체활성, 안전성을 적절하게 유지하고 결정짓는데 중요한 요소가 된다. 게다가, 암의 발생과 진전의 영향으로 인해 당사슬 가지 끝에 결합하는 시알릭산의 당질화 양상의 변화는 세포와 세포간 상호작용, 인식 그리고 면역 반응에 매우 중요한 요소로 작용한다. 본 총설에서는 당사슬의 생물학적인 기능에 대한 전반적인 이해를 돕고, 당질화 현상과 질병 진단 및 질병 치료 기법간의 상호 연관성을 간략히 설명하고자 한다. 추가적으로 혈액 내 혈청에 존재하는 당사슬의 프로파일의 변화를 분석하는 대량효능검색 방법과 이로 인해 유도되는 생화학적 작용 기작을 살펴보았다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제35권6호
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• pp.535-543
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• 2020

유전적 조절, 유전자 발현 그리고 환경적 단서, 화학적 신호에 대응하는 표현형 변이에서 세포 RNA는 ubiquitous 역할 이외에도 세포 외 RNA(exRNA)라 하는 새로운 형태의 RNA는 추후 연구의 방향을 제시한다. exRNA는 membrane vesicles 또는 세포 외 소포체(EV)로 알려진 membrane blebs를 통해 세포 외부로 운반된다. EV의 형성은 원핵생물, 진핵생물, 고세균을 포함한 모든 미생물군에 우세하게 보존되어있다. 본 리뷰는 세균 유래 exRNA에 관해 세가지 주제에 초점을 두었다. exRNA의 발견과 박테리아 유전자 배열에 대한 외부 RNA의 영향, b. exRNA의 분비기작을 통한 방출, c. 다른 그람음성 및 그람양성균에 의해 분비되는 exRNA로 고안될 수 있는 응용 가능분야이다. 본 리뷰에서 장내 미생물군의 probiotics 및 후성유전학적 규제에서 본 exRNA와 exRNA마커와 같은 EV파생 응용프로그램에 대한 의견을 제공할 것이다.

• 생명과학회지
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• 제23권6호
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• pp.796-803
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• 2013

전통막걸리들에서 순수분리한 효모균주 5종을 이용하여 각각 막걸리를 제조하면서 발효 시일에 따른 막걸리의 물성 변화와 PCR-DGGE를 이용하여 미생물 군집구조 변화를 조사하였다. 막걸리의 pH는 0일째 pH 6에서 발효 2일째 pH 3 정도의 큰 감소를 보였고 이후 큰 변화가 없었다. 발효일별로는 차이를 보였지만(ANOVA, p<0.001) 균주별로는 차이가 없었다(p=0.60). 산도는 0.19~1.04% 범위였으며 발효 2일째부터 증가하였고 발효일자별(p<0.001) 및 균주별(p=0.006) 모두 차이가 있었다. C 균주의 산도 증가가 가장 컸으며 S 균주의 산도 증가가 가장 적었다. 아미노태 질소는 S 균주가 8일째 0.442%로 높은 값을 보였지만 다른 균주들은 모두 0.150% 이하를 나타내었다. 발효일자별(p=0.4558) 및 균주별(p=0.3513) 모두 큰 차이를 보이지 않았다. 당도는 빵효모균주인 C가 발효 4일 째부터 다른 균주들에 비해 높았고 발효일자별(p<0.0001) 및 균주별(p=0.007) 모두 유의미한 차이를 보였다. 알코올 함량은 모든 효모균주에서 발효 2일째 10%의 급격한 증가를 보였으며 그 이후에 큰 차이가 없었다. 발효일자별(p<0.0001)로는 차이를 보였지만 균주별로는 차이는 없는 것으로 나타났다(p=0.1464). DGGE 밴드로 검출된 우점세균은 산성물질을 생산하며 기능성을 보이는 Lactobacillus fermentum와 Pediococcus pentosaceus였고, 우점진균은 Saccharomyces cerevisiae였는데 이는 효모균주 첨가에 의한 결과로 판단된다.

• 한국해양학회지:바다
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• 제20권1호
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• pp.53-62
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• 2015

동해 울릉 분지 내 메탄 하이드레이트가 매장된 지역에서 혐기적 메탄 산화와 연관된 미생물 군집 특성을 이해하기 위해 메탄 누출이 있는 대륙사면 정점(UBGH2-3)과 메탄 누출이 없는 분지 정점(UBGH2-10)에서, (1) 퇴적물의 지화학적 성분 및 황산염 환원율을 측정하였으며, (2) 기능성 유전자 분석을 통해 혐기적 메탄 산화 미생물 및 황산염 환원 미생물 군집의 정량 및 다양성 분석을 수행하여 그 결과를 비교하였다. 황산염-메탄 전이지대(sulfate and methane transition zone, SMTZ)는 UBGH2-3에서 0.5~1.5 mbsf (meters below seafloor), 그리고 UBGH2-10에서는 6~7 mbsf에 분포하는 것으로 나타났다. 두 지역의 SMTZ에서 측정된 황산염 환원율은 UBGH2-3의 1.15 mbsf에서 $1.82nmol\;cm^{-3}d^{-1}$으로 나타났고, UBGH2-10의 SMTZ에서 황산염 환원율은 $4.29nmol\;cm^{-3}d^{-1}$으로 높은 값을 보였다. 총 미생물 16S rRNA gene과 기능성 유전자인 mcrA (methyl coenzyme M reductase subunit A) 및 dsrA (dissimilatory sulfite reductase subunit A)의 정량 PCR 결과 두 정점의 SMTZ 부근에서 상대적으로 높게 검출되었다. 그러나 UBGH2-10지역에서 mcrA 유전자는 SMTZ 아래인 9.8 bmsf에서 가장 높게 검출되었다. mcrA 유전자의 다양성 분석 결과 두 지역의 SMTZ와 그 아래 퇴적층에서 혐기성 메탄산화 고세균(ANME: Anaerobic MEthanothoph) 군집인 ANME-1이 우점하였다. 한편, ANME-2 군집은 메탄 누출이 발생하는 UBGH2-3지역의 2.2 mbsf 층에서만 관찰되었고, 더불어 dsr 유전자 다양성 분석 결과 ANME-2와 컨소시엄을 이루는 Desulfosarcina-Desulfococcus (DSS) 이 나타났다. 본 연구 결과, ANME-1과 ANME-2은 동해 심부 퇴적 환경에서 혐기적 메탄 산화 및 생성 과정에 관여하는 중요한 고세균 군집으로 사료되며, 또한 ANME-2/DSS 컨소시엄은 메탄이 누출되는 지역인 UBGH2-3과 같이 혐기적 메탄 산화가 활발한 곳에서 메탄 거동을 조절하는 중요한 미생물 그룹으로 인식된다.

• 생명과학회지
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• 제15권3호
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• pp.415-422
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• 2005

Mycobacterium hovis BCG 균주에 transposon을 사용하여 mutagenesis를 수행함으로써 mutant library를 제조하였다. 이 mutant library를 screening하여 항결핵제인 PA-824에 내성을 갖는 mutant들을 얻었고, M. bovis wild type에서는 정상적으로 생성되는 coenzyme $F_{420}$이 대부분의 이들 mutant들에서는 생성되지 않는다는 것을 알게 되었다. 세포 추출액을 HPLC로 분석해본 결과, 그 중에서 한 mutant는 $F_{420}$은 생성하지 않으나 그 전구물질인 F0는 생성하고 있음이 밝혀졌다. 따라서 이 mutant 에서는 $F_{420}$생합성 회로의 마지막 단계가 차단되어있음을 알 수 있다. 이 mutant를 inverse PCR을 통해 분석해본 결과, transposon이 Rv2435c유전자에 삽입되어있는 것을 확인할 수 있었다. Rv2435c유전자는 세포막에 결합되어있는 80.3 kDa의 단백질을 암호화하는 것으로 추정되고, 이 단백질의 N-말단은 periplasm에 존재하고 C-말단은 원형질에 존재하는 것으로 추정되고 있다. 원형질에 존재하는 C-말단은 원핵생물과 진핵생물들의 adenylyl cyclase들과 높은 유사성을 나타낸다. Adenylyl cyclase는 ATP로부터 cAMP를 생합성하는 효소이다 M. tuberculosis나 M. bovis의 genome에는 class III adenylyl cyclase를 암호화하는 것으로 추정되는 유전자가 모두 15개나 존재한다 특히 이들 중에서 Rv1625c 와 Rv2435c는 포유류의 adenylyl cyclase들과 높은 유사성을 가지는 것으로 알려져 있다 이 Rv2435c 단백질이 진정한 adenylyl cyclase인지를 확인하기 위하여 우리는 이 단백질 중에서 원형질에 존재하는 부분을 말단에 6개의 histidine을 첨부한 채로 대장균에서 발현시켰다. 대장균에서 이 단백질이 생성되는 것은 histidine이 첨부된 단백질을 Ni-NTA resin을 사용하여 대장균으로부터 분리함으로써 확인하였다. 그러나 이 단백질이 대장균에서 cya mutation을 complementation하지 못하였고, 따라서 이 단백질이 adenylyl cyclase 활성을 갖지 않음을 알 수 있었다. 자외선이나 hydroxylamine을 사용한 mutagenesis 또는 Rv2435c와 Rv1625c간의 토sion단백질을 만들어서, 이 단백질이 adenylyl cyclae로서의 활성을 획득하도록 하는 모든 시도는 실패하였다. 따라서 Rv2435c단백질이, F0가 $F_{420}$으로 변환되는 데에 영향을 미치는 방법이 cAMP를 생성함으로써가 아니라 다른 방법으로 영향을 미치고 있다는 것을 알 수 있었다.

• 해양환경안전학회지
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• 제27권7호
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• pp.924-942
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• 2021

여름철 장강 저염수의 확장은 북부 동중국해의 환경 및 식물플랑크톤 다양성과 군집구조에 영향을 미치는 주요 요인으로 알려져 있다. 2020년 하계는 장강 저염수의 방류량이 매우 높았던 시기로 환경 특성 변화에 따라 식물플랑크톤 다양성 및 군집구조에 미치는 동력을 이해하기 위해 현장관측을 수행하였다. 2020년 8월 16일~17일 이어도호 승선조사와 2020년 8월 15일~21일 이어도 해양과학기지(IORS)에서 체류조사를 실시하였다. 조사 정점들에서 CTD로 측정한 결과 조사 수역 남서쪽은 장강 저염수의 영향을 받아 염분이 낮고 엽록소 형광값이 높았으며, 대마난류의 영향을 받은 남동수역은 염분이 높고 엽록소 형광값이 낮았다. 12개 정점의 표층수 시료의 엽록소 a 농도는 미소형(20~3 ㎛) 및 소형(> 20 ㎛) 식물플랑크톤의 생체량이 우점함을 나타냈으며, 대마난류수의 영향을 받은 정점에서만 초미소 식물플랑크톤(< 3 ㎛) 생체량이 약 50%를 차지하였다. 이러한 표층수의 식물플랑크톤 크기 분포는 영양염류 공급과 관련되어 장강 저염수의 높은 질산염 공급을 받는 정점들은 소형 식물플랑크톤의 생체량 기여율이 높았다. 형태분류 결과 미소형 및 소형 식물플랑크톤은 총 45종이며, 이들 중 우점 분류군은 규조류인 Guinardia flaccida, Nitzschia spp.와 와편모조류인 Gonyaulax monacantha, Noctiluca scintillans, Gymnodinium spirale, Heterocapsa spp., Prorocentrum micans, Tripos furca 등이었다. 대마난류의 영향을 받으며 질산염 농도가 낮은 정점들은 광합성 초미소 진핵생물(PPE)의 개체수와 광합성 초미소 원핵생물(PPP)인 Synechococcus의 개체수가 높았다. 질산염/인산염 비는 대부분 정점에서 인산염 제한을 받고 있음을 나타냈다. 유세포 분석 결과 Synechococcus 개체수는 난류의 영향을 받는 빈영양 수역의 정점들에서 높은 개체수를 보였다. NGS 분석 결과 PPP 중 Synechococcus는 29개의 clades가 나타났고, 이 중 한 시료에서 한 번이라도 1% 이상의 우점율을 보인 clade는 11개로 나타났다. 표층수에선 clade II가 우점분류군이었으며 SCM 층에서 다양한 clades(I과 IV 등)가 차우점군들로 분포하였다. Prochlorococcus 속은 난류 수역에서 high light adapted 생태형이 출현하는 양상을 보였으며 북쪽 수역에선 출현하지 않았다. PPE는 총 163개의 높은 operational taxonomic units(OTUs) 다양성을 보였으며, 이 중 한 시료에서 한 번이라도 5% 이상의 우점률을 나타낸 OTU는 총 11개였다. 장강 저염수의 영향을 받는 정점의 표층수에선 Amphidinium testudo가 우점 분류군이었으며, SCM 층에서 녹조류가 최우점하였다. 대마난류의 영향을 받는 해역에서는 다양한 분류군의 착편모조류가 우점하였다. IORS에서의 관측 결과도 주변 정점들과 식물플랑크톤 생체량, 크기분포, 다양성에서 유사한 수준을 나타냈다. 이번 연구 결과는 장강 저염수의 영향에 따른 식물플랑크톤의 반응을 다양한 분야에서 확인할 수 있었다. 또한, IORS와 승선조사를 비교하여 IORS 관측이 장강 저염수의 식물플랑크톤 동적 역학 모니터링에 활용할 수 있음을 확인하였다. 향후 기후변화에 따라 나타날 동중국해 하계 환경 및 생태계의 변화에 대비하여 IORS의 효과적 이용 방안 수립이 필요할 것으로 판단된다.