Isolates of Trichoderma spp. collected from Pleurotus ostreatus and P. eryngii beds, which included loosened substrate compactness and development of green colour, were grouped into three species. The occurrence of different species of Trichoderma was as T. cf. virens(70.8%), T. longibrachiatum(16.7%) and T. harzianum(12.5%). The conidia of Trichoderma spp. were ellipsoidal, obovoid and phialides were bowling pins, lageniform and the length of phialides was $3.5{\sim}10.0{\times}1.3{\sim}3.3{\mu}m$. Phialides of T. cf. virens and T. harzianum were tending clustered, but it was solitary disposition in T. longibrachiatum. T. cf. virens was characterized by predominantly effuse conidiation, sparingly branched, and fertile to the apex and it was penicillate type. RAPD analysis could detect variability amongst three different species of Trichoderma using two newly designed URP-primers. However, intra-specific variation could not be detected in all the isolates except for rDNA sequence data classified Trichoderma isolates into three distinct groups representing three species. The profiles of rDNA sequences of isolates representing a species showed high similarity in T. cf. virens and T. harzianum. However, there was a variation in rDNA sequences of isolates representing T. longibrachiatum. The results of present study reveals that molecular techniques of RAPD and rDNA sequencing can greatly aid in classification based on morphology and precise identification of fast evolving species of Trichoderma.
본 실험결과 느타리버섯속에서의 재현성 있는 최적 RAPD 조건은 $50\;{\mu}l$ 반응액에서 80 ng template DNA, 30 pmole primer, $200\;{\mu}M$ dNTP, 2 mM $MgCl_2$, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCI(pH 9.0), 0.1% Triton X-100, 1.5 unit Taq polymerase(promega)였다. 여섯 개의 primer가 Pleurotus속 8종의 균주에서 RAPD polymorphism을 보임을 알 수 있었으며, 이들의 염기배열은 PR2(GGG GGG AAG C), PR3(GCG GTT GAG G), PR4(CGC ACC GCA C), PR10(CAA TCG CCG T), PR11(CAG CAC CCA C), PR17(TAG GCG TAT CAG GAG GCC CT)이었다.
본 연구의 목적은 식용 및 약용버섯인 아위(阿魏)버섯(Pleurotus ferulae) 균주와 느타리버섯속(Pleurotus spp.) 종간의 유전적 유연관계를 이해하는 것이었다. RAPD 분석결과 이들 버섯 종들은 유사도 80% 수준에서 7개의 그룹으로 분류되었다. 노랑느타리(P. cornucopiae), 사철 2호(P. florida), 여름 2호(P. sajor-caju)는 각각의 그룹으로 분류 되었고, 큰느타리 균주인 26060과 P. fuscus var. ferulae 균주인 26065은 같은 그룹으로 분류되었다. 4개의 느타리 균주는 흑평을 제외한 수한 1호, 원형 1호, 춘추 1호가 한그룹을 형성하였고, 아위버섯 균주 중 일본설이를 제외한 박달, 아위, 천산 1호, 아위예산 균주가 하나의 그룹을 형성하였다. 아위버섯 균주인 일본설이는 느타리 균주인 흑평과 같은 그룹에 속하였다.
느타리속에 속하는 버섯은 예로부터 인체에 이로운 생리 활성물질을 많이 함유한 버섯으로 알려져 왔다. 최근 우리나라에서 노랑느타리와 분홍느타리의 재배가 증가함에 따라 이들 버섯의 유전적 다양성과 유연관계의 규명이 필요하게 되었다. 이에 우리나라와 해외 지역에서 수집한 노랑느타리4균주, 분홍느타리 3균주 그리고 느타리 4균주를 대상으로 rDNA의 ITS region 염기서열과 genomic DNA의 RAPDPCR을 수행하였다. ITS1과 ITS2 영역의 염기의 수는 각각 167에서 254쌍, 156에서 213쌍으로 계통에 따라 변이가 있었고 5.8S 영역의 염기의 수는 노랑느타리 균주는 158쌍이었고, 분홍느타리와 느타리 균주는 157쌍으로 동일하였다. 각각의 균주 간 유연관계를 알아보기 위해 본 실험에 사용한 11균주와 NCBI GenBank에 염기서열이 등록되어있는 노랑느타리 3균주, 분홍느타리 2균주, 느타리 1균주의 ITS 영역의 염기서열을 이용하여 분지도를 작성한 결과, 4개의 클러스터로 나눠지는 것으로 나타났다. 분홍느타리와 느타리의 균주는 큰 클러스터 내에서는 하나의 클러스터에 속했지만 각각의 종은 이 클러스터 내에서 각기 서로 다른 2개의 소그룹으로 나누어졌다. 또한 20 종류의 primer를 이용하여 RAPD를 수행한 결과 10개의 primer가 효과적으로 염색체 DNA를 증폭하는 것으로 나타났다. 증폭의 양상은 느타리속의 계통과 primer의 종류에 따라 다르게 나타났는데, 증폭된 DNA의 단편 수는 균주 당10개, 단편의 크기는 0.1 kb에서 2.0 kb까지 다양하였다. 본 실험 결과 실험에 사용한 느타리속 균주의 계통과 품종간의 유연관계는 높았고 느타리속의 동일한 종은 우리나라, 중국 및 일본에서 수집한 장소와 상관없이 상동성이 높았다.
느타리버섯 균상에 발생하는 Hypocrea속 균의 분류학적 위치를 확립하기 위하여 유성세대 및 무성세대의 형태적 특징을 조사하였고, 국내 분리 균주의 RAPD, RFLP, URP-PCR 분석 등 분자생물학적 특징을 조사하였다. 1. 충남과 전남 일대의 8개 시, 군의 느타리 재배사에서 19 균주를 분리하였으며 이들 균주간의 형태적, 발생생태학적 변이는 없었고, 기존 보고된 Hypocrea 종들과는 다른 형태적 특징을 나타내었다. 2. Hypocrea 자좌의 크기는 $6.0{\sim}13.0{\times}3.0{\sim}11.0mm$이었고, 위유조직으로 구성되어 있으며 대부분 군생하고 처음엔 백색이지만 성숙되면 노란빛을 띤 갈색을 나타내었다. 자낭각은 구형으로 크기가 평균 $239.9{\times}204.1{\mu}m$이었으며, 자낭에는 16개의 자낭포자(part ascospores)를 형성하였고, 자낭과 장낭포자의 크기는 각각 $103.3{\times}4.9{\mu}m$와 $6.5{\times}4.7{\mu}m$이었다. 3. 무성세대의 phialide는 보통 Trichoderma virens와 유사한 형태로 모여서 형성되나 때때로 penicillate의 형태도 관찰되었다. T. virens형 phialide의 크기는 $10.8{\times}3.5{\mu}m$이었고 penicilliale형은 $14.7{\times}3.4{\mu}m$이었다. 분생포자는 계란형에서 타원형으로 표면은 매끈하고 크기는 $4.5{\times}2.9{\mu}m$이었다. 4. Hypocrea 균주들의 배양적 특징 조사한 결과, PDA 배지에서 균사생장 최적 온도는 $25^{\circ}C$이었고 자좌는 $15{\sim}25^{\circ}C$ 범위에서 발생하였으며 자좌 발생 최적 온도는 $20^{\circ}C$였다. 5. RAPD 및 RFLP 분석을 실시한 결과 Hypocrea속 균은 공시균주는 모두 단일 유전 개체군으로 느타리 재배사에서 발생하는 Trichoderma속 균 및 기존에 보고된 Hypocrea spp.와는 다른 분류군으로 나타났다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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