• KSBB Journal
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• 제14권5호
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• pp.523-527
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• 1999

A naturally luminescent bacterium, Photobacterium phosphoreum was stored in 2.5% NaCl solution at 2$0^{\circ}C$, 4$^{\circ}C$, -2$0^{\circ}C$ and -7$0^{\circ}C$ for 30 days. In vivo luminescence and concentrations of total and culturable cells were determined by luminometer, spectrophotometer and dilution plate counting, respectively. When stored at 4$^{\circ}C$ and 2$0^{\circ}C$, concentrations of cells were rapidly decreased as a result of cell lysis, leading to adrop in turbidity and cultured counts. The bioluminescence of cells stored at 4$^{\circ}C$ was maintained until 12 days while those of cells starved at other temperatures decreased to background level within 3 days. Following incubation of stored cells in fresh liquid medium, activities of viable cells increased throughout storage period excepting cells stored at 2$0^{\circ}C$. Changes in bioluminescence intensity following addition of 2.5% NaCl solution markedly showed in cells stored at -2$0^{\circ}C$ and -7$0^{\circ}C$ and increased to maximum 8 fold.

• Journal of Microbiology
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• 제42권3호
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• pp.194-199
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• 2004

Investigation of the expression of the riboflavin (rib) genes, which are found immediately downstream of luxG in the lux operon in Photobacterium phosphoreum, provides more information relevant to the evolution of bioluminescence, as well as to the regulation of supply of flavin substrate for bacterial bioluminescence reactions. In order to answer the question of whether or not the transcriptions of lux and rib genes are integrated, a transcriptional termination assay was performed with P. phoxphoreum DNA, containing the possible stem-loop structures, located in the intergenic region of luxF and luxE ($\Omega$$\_$A/), of luxG and ribE ($\Omega$$\_$B/), and downstream of ribA ($\Omega$$\_$c/). The expression of the CAT (Chloram-phenicol Acetyl Transferase) reporter gene was remarkably decreased upon the insertion of the stem-loop structure ($\Omega$$\_$c/) into the strong lux promoter and the reporter gene. However, the insertion of the structure ($\Omega$$\_$B/) into the intergenic region of the lux and the rib genes caused no significant change in expression from the CAT gene. In addition, the single stranded DNA in the same region was protected by the P. phosphoreum mRNA from the Sl nuclease protection assay. These results suggest that lux genes and rib genes are part of the same operon in P. phosphoreum.

• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
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• 제2권2호
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• pp.141-146
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• 1997

A new sensing system based on the immobilization of luminescent batcteria, Photobacterium phosphoreum, was proposed for continuous real-time monitoring of polluants. The response curves demonstrate that Photobacterium phosphoreum immobilized on the strontium alginate was very sensitive to seven reference chemicals used. The significant inhibitory concentrations for bioluminescence emission were 5 ppm for Pb(NO3)2, NiCl2, CdCl2, 50 ppm for NaAsO2, 0.1ppm for HgCl2, 0.5ppm for pentachlorophenol and less than 5ppm for SDS, respectively. The alginate mixed-cells (AMC) retained their luminescence during experimental period (29 days) under storage condition of -8$0^{\circ}C$. The variables affecting performance of continuous flow through monitoring (CFTM) were optimized in order to ensure stability and efficiency. The flow through cell with strontium-alginate immobilized luminescent bacteria was tested with salicylate and 4-nitrophenol and a rapid response of luminescence was recorded by time drive mode in bioluminescence spectrometer after exposure to both toxicants.

• KSBB Journal
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• 제14권3호
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• pp.342-350
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• 1999

P. phosphoreum을 이용하여 연속 모니터링 시스템을 개발하고자 free cell과 고정화 세포의 중금속 물질에 대한 반응을 일차로 조사하였다. 고정화 물질로는 절차가 비교적 간단하고 bioluminescence 투과성에 영향을 주지 않는 sodium algmate를 사용하였다. Alginate는 발광미생물의 빛 발생 대사를 저해하지 않을 뿐만 아니라 bioluminescence의 투과성이 탁월하였다. 중금속 물질 중에서 $HgCl_2$, $CdCl_2$, $MnSO_4$, $ZnSO_4$를 선택하여 free cell과 alginate 혼합 세포 및 strontium alginate에 고정화한 세포에 노출시켜 반응을 조사하였으며, 또한 독성 및 strontium alginate에 고정화한 gel을 disc type으로 제조하여 중금속 물질에 대한 bioluminescence의 변화를 조사하였다. Free cell과 disc type의 세포가 alginate 혼합세포 및 strontium alginate로 고정화한 세포에 비해서 비교적 민감한 반응을 보였으며 중금속 물질의 농도에 대하여 bioluminescence intensity의 감소율이 비례하여 나타났다. 특히, 고정화 세포인경우 free cell 보다 중금속의 mass transfer에 미치는 영향 때문에 민감성은 떨어지지만 모두 linear regression curve를 나타내었다. Disc type의 경우 alginate에 혼합한 세포와 strontium alginate로 고정화한 세포보다 민감한 반응을 보인 것은 중금속에 노출된 면적이 넓기 때문으로 사료된다. 독성물질에 대한 반응분석을 위하여 Gamma value로부터 $EC_{50}$을 계산하였으며 이를 이용하여 각 중금속 물질의 농도와 P. phosphoreum의 bioluminescence intensity와의 상관관계 및 각 중금속 물질의 독성정도를 산출하였다. $EC_{50}$값을 이용하여 독성정도를 볼 때 4가지 type 모두 $HgCl_2$가 가장 독성이 강한 것으로 나타났다. 본 연구결과를 종합해 볼때 P. phosphoreum을 고정화 할 경우 bioluminescence에 거의 영향을 미치지 않을 뿐만 아니라 bioluminescence의 안정성에도 기여하기 때문에 모니터링 시스템에 적용할 수 있다. 특히 disc type의 고정화 제재는 free cell과 동등한 민감도를 나타내었기 때문에 빛 안정성을 유지하면서 수질 모니터링을 위한 bioluminescence제재로 이용이 가능하다.

• Journal of Microbiology
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• 제38권2호
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• pp.80-87
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• 2000

The nucleotide sequence of the luxC gene coding for lux-specific fatty acyl-CoA reductase and the upstream DNA (325bp)of the structural gene from bioluminescent bacterium, Photobacterium phosphoreum, has been deternubed. An open reading frame extending for more than 20 codons in 325 bp DNA upstream of luxC was not present in both directions. The lux gene can be translated into a polypeptide of 54 kDa and the amino acid sequences of lux specific reductases of P. phosphoreum shares 80, 65, 58, and 62% identity with those of the Photobacterium leiognathi, Vibrio fischeri, Vibrio harveyi, and Xehnorhabdus luminescenens reductases, respectively. Analyses of codon usage, showing that a high frequency (2.3%) of the isoleucine codon, AUA, in the luxC gene compared to that found in Escherichia coli genes (0.2%) and its absence in the luxA and B genes, suggested that the AUA codon may play a modulator role in the expression of lux gene in E. coli. The structural genes (luxC, D, A, B, E) of the P. phosphoreum coding for luciferase (${\alpha}$,${\beta}$) and fatty acid reductase (r, s, t) polypeptides can be expressed exclusively in E. coli under the T7 phage RNA polymerase/promoter system and identificationof the [35S]methionine labelled polypeptide products. The degree of expression of lux genes in analyses of codon usage. High expression of the luxC gene could only be accomplished in a mutant E. coli 43R. Even in crude extracts, the acylated acyl-CoA reductase intermediate as well as acyl-CoA reductrase activities could be readily detected.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제7권4호
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• pp.242-249
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• 1997

Stability of bioluminescence was investigated with Photobacterium phosphoreum immobilized on the strontium alginate in order to develope continuous real time monitoring of pollutants. The stability of bioluminescence emission was improved by prolonged aging time. The aging time of ${\geq}40$ min and the cell concentration of ${\leq}0.6\;of\;OD_660$ were selected for the immobilization of P. phosphoreum to give linearity between cell concentrations and bioluminescence intensity. In sensitivity tests using phenol, it was found that this compound quenched bioluminescence proportional to the concentration without lowering of cell growth. The lower value for maximum quenching ($q_s$) and higher dissociation constant ($K_s$) were observed with strontium-alginate immobilized cells compared to free cells. The response of bioluminescence to toxicants was evaluated with the immobilized luminescent bacteria. The sensitivity of the immobilized cells was found to be good in response to toxicants, 4-nitrophenol, salicylate and cadmium, when evaluated with a specific rate of bioluminescence quenching.

• KSBB Journal
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• 제15권1호
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• pp.49-54
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• 2000

1.0%(w/v)의 CMC 담체는 고정화를 유지할 수 있는 점도를 가지며 0.1 M 이하의 양이온과 이온가교결합을 할 수 있는 농도이다. Luminometer tube내의 시료에 유동을 최소화함으로써 산소의 공급을 일정하게 하여 P. phosphoreum을 고정화 30분 후 bioluminescence intensity가 안정되어 바로 측정할 수 있는 장점을 가지고 있었다. 1.0%(w/v) CMC담체는 pH 6.92로 최적조건인 pH 7.0에 근접했으며, 발광기작에 필요한 산소전달(oxygen transfer)이 1.5%(w/v)~3.0%(w/v) CMC 담체보다 뛰어나 Bioluminescence intensity의 안정성을 부여하였다. Cr-화합물인 $Na_{2}CrO_{4}$, $K_{2}CrO_{4}$, $CrO_{3}$, CrK$(SO_4)_{2}$ 및 $CrCl_{3}$의 CMC담체에 대한 민감도는 $\gamma$값을 이용해서 $EC_{50}$값으로 나타내었을 때 $Na_{2}CrO_{4}$, $K_{2}CrO_{4}$, CrK$(SO_4)_{2}$ 및 $CrCl_{3}$ 의 $EC_{50}$값이 1.0%(w/v)CMC에서는 5.4~16.3 g/L으로 1.5%(w/v)~3.0%(w/v) CMC에서는 6.2~555.9 g/L의 범위로 나타났다. 이것은 1.0%(w/v) CMC가 낮은 독성 농도에서 bioluminescence intensity가 50% 감소함을 알 수 있고, 상관계수($R^2$)가 0.911~0.990 으로 높게 산출되었다. 따라서 1.0%(w/v) CMC 담체가 P. phosphoreum의 biolumincsene에 안정성을 주었으며, 독성물질에 가장 민감하다는 것을 알 수 있었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제28권2호
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• pp.117-123
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• 2000

P. phosphoreum의 생존과 생체발광도는 온도에 의해 많은 영향을 받는다. 냉동 저장한 세포의 경우 glycerol의 보호 작용으로 세포농도와 생균수는 측정기간 동안 일정하게 유지된 반면 생체발광도는 glycerol 첨가 직후 급속히 감소하였으며, 저장 이후에도 감소된 생체발광도가 활성화되지 못하였다. 최적 생육온도인 $20^{\circ}C$의 경우 저장 초기 세포가 성장함에 따라 세포수의 증가를 보였으나 일정 시간 이후 세포 분해 현상으로 인하여 생균수 및 세포 집락수의 감소를 나타내었으며, 생체발광도는 저장 3일 이후 소멸되었다. 이와는 대조적으로 $4^{\circ}C$에 저장한 세포의 생체발광도는 저장 10일 동안 지속되어 가장 높은 생체발광 유지도를 나타내었으나 장기간 저온 저장으로 인하여 세포가 VBNC 상태에 돌입됨에 따라 총균수와 생균수는 일정한 반면 저장 10일 이후 세포 집락수의 급격한 감소를 나타내었으며, 저장 20일 이후 간균에서 구균으로 세포 형태상의 변화를 나타내었다. 이에 따라 세포 저장 시 접종원의 농도를 달리하여 VBNC 상태와 생체발광도의 관련성을 조사한 결과 VBNC 세포가 증가할수록 생체발광도의 감소를 나타내었다. 따라서 VBNC 세포를 감소시키기 위하여 세포를 고정화하여 저장한 결과 별도의 활성제 없이 실온에서 다시 활성화되어 고정화하지 않은 세포에 비해 2.3배 높은 생체발광유지도를 나타내었으며, 저온저장에 따른 platebility 소실과 세포 응축현상이 나타나지 않았다. 이러한 결과는 세포의 고정화 방법을 이용하여 $4^{\circ}C$에서도 세포의 생존 및 생체발광 유지도를 향상시킬 수 있으며, 동결 건조법의 단점을 보완해 줄 것으로 생각된다.

• KSBB Journal
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• 제15권3호
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• pp.299-306
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• 2000

발광미생물 (luminescent bacteria)인 P. phosphoreum을 이용한 수계의 환경독성물질로 지정된 ethane, benzene, phenol류에 chlorine이 치환된 l47~의 독성강도를 생체발광의 50%저하시키 는 독성농도인 ECso값을 통한 생물학적 정량을 하였을 때 phenol) benzene) ethane 의 순서로 독성깅도가 높게 산출되 어졌으며, 특히 지환된 chlo괴ne의 수가 증가할수록 독성강도가 강하다는 것을 알 수 있었다. 또한 산출된 ECso값을 이용허여 독성물질들의 물려화학적 parameter특성인 octan이(water 분할계 수 (log P), 용해도 (log S) 및 solvatochromic parameter의 떤관쟁 을 QSAR 모탤링하였으며 실힘을 통하지 않고, 독성의 독성강도 를 예측할 수 있는 회기식을 다음과 같이 산출하였다. $log EC_{50} =2.48 + 0.914 log S(n=9 R2=85.5% RE=0.378) log EC_{50}=0.35 - 4.48 Vi/100 + 2.84 \pi^* +9.46{\beta}m-4.48am (n =14 R2=98.2% RE=0.012) log EC_{50} =2.64 -1.66 log P(n=5, R2=98.8% RE=0.16) log EC_{50}=3.44 -1.09 log P(n=9 R2= 80.8% Re=0.207)$. QSAR 모델은 QSAR 검증식을 통하여 확인된 다중회기식을 이용함으로 실험하지 않은 독성물 질이 갖는 물리화학적인 특성을 대입하여 log Eeso값을 예측할 수 있으므로 경제적, 시간적으로 이익을 얻을 수 있는 모델이다.

• BMB Reports
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• 제33권4호
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• pp.353-357
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• 2000

A new assay method of ${\alpha}-Oxidase$ (fatty acid : oxygen dioxygenase, 1-decarboxylating) was developed using a bioluminescence reaction system of marine luminous bacterium, Photobacterium phosphoreum. ${\alpha}$-Oxidase was isolated from a cucumber (Cucumis sativus). Pentadecanoic acid was used as a substrate, and the product, tetradecanal, was analyzed with a bacterial luciferase-coupled reaction. Initial light intensity was directly related to the concentration of tetradecanal in the range of 1 nM to 10 ${\mu}M$. Optimal pH and temperature were 7.5 and $25^{\circ}C$, respectively. Optimal pentadecanoic acid concentration in a standard assay of ${\alpha}$-oxidase was 0.1 mM. The Km value of pentedecanoic acid was $85{\mu}M$. This method is straightforward, rapid, convenient, and easy. Its needs no treatment or extraction of reaction mixture.