생리 및 상업적 응용분야에서 중요한 위치를 차지하는 단백질 분해효소는 펩타이드 결합의 가수분해를 촉매한다. 단백질 분해효소를 생산하는 신규 균주를 분리하기 위하여 부패한 나무로부터 균을 분리하여 1% skim milk가 포함된 LB 배지에서 투명환의 생성 능력이 높은 두 균주 WD12와 WD32를 선발하였다. 선발균주의 동정을 위하여 16S rRNA gene의 염기서열을 결정한 후 GenBank 상에 등록된 서열들과 상동성을 조사한 결과, WD12는 Pseudoxanthomonas mexicana와 97.8%, WD32는 99.8%의 상동성을 보여주었다. 계통적 유연관계를 조사한 결과 이들 균들은 P. mexicana와 P. japonensis와 cluster를 형성하였다. WD12와 WD32는 그람 음성 간균으로 catalase와 oxidase 활성을 보였다. WD12의 경우 P. mexicanna와 달리 malate를 동화할 수 있었으며, D-mannose를 동화할 수 없었다. 두 균주의 최적 단백질 분해효소를 생산하는 온도는 $35-37^{\circ}C$로 나타났으며, 최대활성은 WD12가 656 unit/ml, WD32가 267 unit/ml을 나타내었다.
본 연구의 목적은 위치특이적 펩타이드 및 단백질을 사용하여 재조합 대장균에서 활성형 인간 상피세포성장인자(hEGF)를 고효율로 발현할 수 있는 방법을 찾아내는 데 있다. 재조합 대장균내 cytoplasm 및 periplasm 영역에서 hEGF의 발현을 위해 각각 세개의 응합 펩타이드 및 단백질을 선정하여 상호 비교하였다. 재조합 대장균에서 hEGF의 발현유도시 대부분 불용성 단백질로 생산되는 현상을 극복하기 위해 cytoplasm영역에서는 ATS, thioredoxin, 리파제를 융합파트너로 사용하였으며 periplasm 영역에서는 foldase인 DsbA와 DsbC, 용융성 고발현 단백질인 maltose binding protein을 선택하여 사용하였다. Periplasm영역에서 발현유도를 시키는 융합단백질의 경우 cytoplasm영역에서의 발현양도 용융성 형태로 고발현 되는 것을 알 수 있었으며 전체적으로 약 2배가량의 용융성 형태로 발현되었다. hECF의 발현율을 가장 높일 수 있는 융합단백 질은 maltose binding protein이었으나 발현된 융합단백질의 24%가 불용성 단백질로 형성되어 활성형 형태로 얻는 데 한계가 있었으며, 활성형 형태로 hEGF의 발현을 위해서는 DsbA를 응합단백질로 사용한 경우에 18.1 mg/L로 가장 높은 발현농도를 보였다. Cytoplasm 영역에서 발현유도를 한 경우에는 ATS와 thioredoxin을 응합파트너로 hEGF를 발현한 경우 용융성 형태로 높은 발현율을 보였다. 특히 ATS와 같은 펩타이드를 N-말단에 융합시킨 경우 불용성을 방지하는 효과를 보여 이황화결합의 불완전성이나 소수성으로 인해 불용성 단백질로 발현되는 기존의 단백질을 활성형 형태로 발현하는데 될 수 있음을 확인할 수 있었다.
계난백(鷄卵白) Lysozyme N-와 C 말단(末端) 항원결정기(抗原決定基)($P_{17}$: sequence $Lys^1-{cys-}^6-Asn^{27},\;{Trp^{12}}_2-Cys^{127}-Leu^{129}$)의 특이성(特異性)에 대(對)하여 연구(硏究)했다. $^{14}C-acetyl$ Lysozyme 과 정제(精製)한 guinea pig 항(抗)-$P_{17}$ 항체(抗體)와의 결합(結合)을 Scatchard plot 상(上)에서 나타낸 결과(結果) 그 실험치(實驗値)가 거의 r=1였다. 이것은 Lysozyme에 대(對)하여 각각(各各) 다른 친화성(親和性)을 가진 2개(個)의 항체군(抗體群)의 존재(存在)나 그렇잖으면 제(第)1의 항체결합부위(抗體結合部位)에 최초(最初)의 Lysozyme 분자(分子)가 결합(結合)함으로 인(因)하여 항체분자(抗體分子)의 제(第)2의 결합부위(結合部位)에 다른 Lysozyme 분자(分子)의 결합(結合)을 방해하는 즉 steric hindrance에 의한 가능성(可能性)을 시사(示唆)한다. 여러가지 peptides의 항원활성(抗原活性)을 $^{14}C-acetyl-P_{17}$과 항(抗)-$P_{17}$ 항체(抗體)와의 결합저해(結合沮害)시험에서 측정(測定)했다. 그 결과(結果) 단지 $P_{17}$과 $P_{17}t$(sequence $Lys^1-cys^5-Homoser^{12},\;Trp^{123}-cys^{127}-Leu^{128})$)만이 억제되었고 그 $K_1$치(値)가 각각(各各) $2.0{\times}10^4$과 $8.1{\times}10^3$이였다. 이들 결과(結果)를 종합(綜合)하면 $P_{17}$의 항(抗)-$P_{17}$ 항체(抗體)와의 직접적 결합부위(結合部位)는 $P_{17}$의 말단부위(末端部位)에 국재(局在)해 있는 것을 암시해 준다. 한편 $P_{17}$의 나머지 부분(部分)은 이 항원결정기(抗原決定基) 구조(構造)를 유지(維持)하는데 중요(重要)한 역할(役割)을 할 것으로 생각되며 또한 이 결정기내(決定基內)의 한 개의 disulphide 결합(結合)은 면역학적(免疫學的) 활성(活性)을 나타내는데 필수적(必須的)인 것으로 믿어진다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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