• Applied Biological Chemistry
• /
• 제41권5호
• /
• pp.349-354
• /
• 1998

Bacillus subtillis YG-95가 생산하는 protease를 ammonium sulfate$(35{\sim}85%)$ precipitation, DEAE-separose 6B, sephadex G-100을 통해 분리, 정제하였고 정제된 효소의 특성을 조사하였다. SDS-PAGE로 확인된 효소의 분자량은 약 43 kilodalton이었다. 효소반응의 최적 pH 및 최적온도는 각각 약 pH 10.0와 $55^{\circ}C$이었으며, 효소는 $pH\;5{\sim}12$ 까지 넓은 pH범위에서 안정성을 보였고, $45^{\circ}C$까지의 온도에서 안정하였다. 본 효소는 $Fe^{3+}$와 $Al^{3+}$에 의해서 활성이 저해되었으며, 저해제 중에서는 O-Phenanthroline, PMSF, SDS에 의해서 80%이상 저해를 받았고 SPI에 대한 기질 친화도는 $K_m$은 1.28 mg/mL이었다.

• Applied Biological Chemistry
• /
• 제39권6호
• /
• pp.449-454
• /
• 1996

곤충 병원성 곰팡이 Beauveria bassiana(ATCC7159)로부터 곤충 cuticle 분해 효소인 extracellular protease의 최적 생산 조건을 gelatin, vine serum albumin(BSA), casein 및 polypeptone 등을 첨가하여 조사하였다. 이 효소의 최적 생산 배양 조건은 미량원소를 함유한 0.5% Polypeptone, 50mM potassium phosphate pH 6.0이었다. 이 조건에서 pretense의 생산은 배양 1일 후부터 급격히 상승하여 배양 3일 이후 최대로 생산되었으며 배양액의 pH가 7.0 이상이 되면 효소 생산효과가 거의 없었다. 이 pretenses는 phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF)에 저해받는다. 효소 활성은 pH 8.5와 11.5에서 높게 나타났다. 또한 비변성 isoeletricfocusing gel 전기영동 후 각 gel 절편의 활성을 측정한 결과 protease활성이 세부분에서 나타났다. 따라서 탄소원 및 질소원으로 polypeptone을 이용하여 생산되는 pretense는 세종류 이상인 것으로 판단된다.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제30권1호
• /
• pp.26-32
• /
• 2002

저염상태에서 속성 발효를 통한 멸치 어간장의 대량 생산을 위하여 시중 어간장에서 단백질 분해효소 생산이 우수한 균주를 분리 동정하여, B. amyloliquefaciens HTP-8로 명명하였다. 효소생산을 위한 배양 최적온도, 초기 pH, 그리고 배양시간은 각각 $30^{\circ}C$, pH 7.0과 3일이었다. Jar fermenter 배양시 pH를 7.0으로. 조절한 경우가 조절하지 않은 경우에 비해 효소활성이 최대에 이르는 시간이 단축되었다. 효소의 부분정제는 조효소액을 80% ammonium sulfate에 의한 염석과 CM-Sephadex C-50을 이용하여 정제한 결과, 수율이 0.4%, 정제배수가 43.0배였다. 정제효소의 최적 pH와 온도는 pH 10.0과 $50^{\circ}C$였으며, pH 7.0~l2.0의 pH 범위와 $40^{\circ}$ 이하에서 안정하였다. 금속이온 중 $Ag^{＋}$ /, $Ba^{2＋}$ /에 의하여 효소활성이 저해되었다. 한편, 본 효소는 PMSF에 의하여 선택적으로 활성이 억제됨으로써 활성부위에 serine을 가진 serine protease에 속하는 것으로 판단되었다.

• Applied Biological Chemistry
• /
• 제40권5호
• /
• pp.388-394
• /
• 1997

곤충 병원성 곰팡이 Beauveria bassiana ATC7159의 배양여액으로부터 균체외 protease (basiasin I)를 Ammonium sulfate 침전, DEAE-Sephadex A-50, CM-cellulose 및 Hydroxyapatite column chromatography를 수행하여 완전히 정제하였다. 이 과정으로 41배 정제되었으며 정제수율은 13.6%였다. 정제된 bassiasin I의 분자량은 SDS-PAGE 상에서 약 32,000 Da이며 pI값은 9.5로 확인되었다. $NH_2$ 말단 아미노산 서열은 다른 곤충 병원성 곰팡이가 생산하는 pretense들과 높은 상동성을 보였다. Protease 활성의 최적 pH는 10.5 부근이며, pH 5.0-11.0범위에서 안정하였다. 최대 활성온도는 $60-65^{\circ}C$이며, $60^{\circ}C$에서 120분후에 약 20%의 잔존활성을 보였다. 이 pretense는 phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 및 diisopropyl fluorophosphate (DFP)에 의해 저해된다.

• Applied Biological Chemistry
• /
• 제38권6호
• /
• pp.534-540
• /
• 1995

토양에서 분리된 호알칼리성 coryneform bacteria TU-19는 적어도 세종류의 단백질분해효소(Protease I, II, III)를 생성분비하였다. 이 균주의 효소생산과 관련된 배양조건을 조사해본 결과 최적온도 및 pH는 각각 $30^{\circ}C$와 10.0인 것으로 나타났다. 이틀 배양된 배양액으로부터 이 효소들을 정제하기 위해서 ammonium sulfate fractionation, gel filtration 및 QAE-Sephadex column chromatography 등을 순차적으로 행하였다. 그 결과 이들 세종류의 효소는 SDS-PAGE pattern으로 평가했을 때 single band로 순수 정제되었으며, 각각의 분자량은 120, 80, 45 kDa이었다. 정제된 효소의 특성을 살펴보면 Pretense I과 II의 최적 pH와 온도는 각각 $10.5,\;45^{\circ}C$이었으며, Protease III는 11.0과 $50^{\circ}C$로 나타났다. 또한 이들 세효소는 10 mM PMSF 농도에서 효소활성을 완전히 상실하였으며, pCMB, 1,10-phenanthroline, IAA, EDTA에는 별 영향이 없는 것으로 보아 serine protease의 일종으로 생각된다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
• /
• 제56권3호
• /
• pp.289-296
• /
• 2004

연구배경 : 기도 질환에서 점액이 과량 분비되는 경우 환자에게 불편함을 줄뿐만 아니라 기도 질환 예후에도 나쁜 영향을 미친다. 그러나, 기도 질환에서 점액이 과량 분비되는 것을 효과적으로 막는 방법이 없다. 점액의 성분 중 mucin은 당화 단백질로서 점액이 점성을 띄게 만드는 주요 성분이다. 본 연구를 통해서 mucin 분비 기전에 proteinase가 관여하는지 확인하고 만일 proteinase가 mucin 분비기전에 관여 한다면 어느 proteinase가 그런 역할을 하는지 확인하고자 하였다. 방 법 : (1) mucin 분비 억제 실험 군 특이적 proteinase 억제제를 사용하여 어느 군에 속하는 proteinase가 mucin 분비를 억제하는지 mucin을 생산하는 폐 세포주인 Calu-3를 이용하여 알아보았다. 군 특이적 proteinase 억제제로 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride, serine proteinase inhibitor), E-64(cysteine proteinase inhibitor), Pepstatin(aspartic proteinase inhibitor), 1,10-Phenanthroline(metalloproteinase inhibitor)를사용하였다. 군 특이적 억제제를 Calu-3에 24시간동안 처리하여 분비된 mucin양을 enzyme linked immunoabsorbant assay(MUC5AC)로 정량하였고 그 결과를 대조군과 비교하였다. (2) Mucin 분비 자극 실험 Metalloproteinase 중에서 기도 질환 발병과 관련 있다고 알려진 matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), MMP-12 그리고 TNF-alpha converting enzyme(TACE)를 Calu-3에 24시간 처리하여 분비된 mucin양을 enzyme linked immunoabsorbant assay (MUC5AC)로 정량하였고 그 결과를 대조군과 비교하였다. 결 과 : (1) 군 특이적 proteinase 억제제인 PMSF($10^{-4}M$), E-64($10^{-4}M$), Pepstatin($10^{-6}M$), 1,10-Phenanthroline($10^{-4}M$)는 MUC5AC 분비를 각각 $1{\pm}4.9%$(평균${\pm}$표준오차; 대조군과 비교 시 P=1.0), $-6{\pm}3.9%$ (P=0.34), $-13{\pm}9.7%$(P=0.34), $41{\pm}8.2%$(P=0.03) 감소시켰다(실험 회수 4번). (2) MMP-9(250ng/ml), MMP-12(100ng/ml), TACE(200ng/ml)에 의한 MUC5AC 분비량은 대조군에 비하여 각각 $103{\pm}6%$(P=0.39), $102{\pm}8%$(P=1.0), $107{\pm}13%$(P=0.39)이었다(실험 회수 6번). 결 론 : mucin 분비 기전에 metalloproteinase가 관여함을 시사하지만 MMP-9, MMP-12, TACE는 in vitro 모델에서 mucin 분비에 영향을 미치지 않았다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
• /
• 제11권4호
• /
• pp.558-563
• /
• 2001

A new alkalophilic strain of Bacillus pumilus JB¬05 producing bleach-stable and halo-tolerant alkaline protease was isolated from cement industry effluents in Karnataka, India. The effects of carbon and nitrogen sources on protease production by this alkalophilic strain were observed after a 30-h incubation. A high level of alkaline protease activity was obtained in the presence of starch as the carbon and peptone as the nitrogen sources. The partially purified enzyme showed an optimum temperature and pH activity at $58^{\circ}C$ and 10.5, respectively. The enzyme was completely inhibited by PMSF (95.0%) indicating it as a serine protease. It is bleach-stable as it retained 35% original activity in the presence of 10% (v/v) hydrogen peroxide at $30^{\circ}$C after 2 h and is halo-tolerant as it retained 70% original activity in the presence of 2.5 M sodium chloride at $30^{\circ}C$ after 2 h incubation.

• 한국미생물·생명공학회지
• /
• 제24권3호
• /
• pp.316-320
• /
• 1996

An alkaline proteinase produced by Yarrowia lipolytica TH65 was purified by 40-65% ammonium sulfate fractionation, DEAE-cellulose chromatography, and gel filtration with Sephadex G-100 and Sephadex G-75. The purified enzyme was shown as a single band on SDS-PAGE, and its molecular weight 31,500. Optimum temperature and pH were 40$\circ$C and 8.5-9.0, respectively, and the enzyme was stable below 40$\circ$C and in the pH range of 6-8. The enzyme was strongly inhibited by divalent ions, completely by PMSF, and partially by EDTA, EGTA, and phenanthroline. But the inhibitory effect in the presence of EDTA, EGTA and phenanthroline could be reversed by addition of Ca$^{2+}$. Thus, these results indicated that the purified enzyme was an alkaline serine proteinase (E.C. 3.4.21.14).

• Journal of Plant Biology
• /
• 제37권2호
• /
• pp.175-181
• /
• 1994

해녀콩(Canavalia lineata) 유식물 자엽에서 N-$\alpha$-benzoyl-DL-arginine p-nitroanilide hydrolase(BApNAase)를 부분정제하여 그 성질을 밝혔다. 부분정제한 BApNAase는 purification fold가 77.5이었고 회수율은 7%이었으며 비활성도는 7.75 unit/mg이었다. BApNAase의 분자량은 200 kD이고 젤라틴분해효소 P3인 것으로 밝혀졌으며 최적 pH는 9.5이었다. BApNAase의 Vmax와 Km은 각각 15.5 unit/mg와 1.6 mM로 최대반응속도가 동물의 트립신보다 7배 가량 낮은 반면에 N-$\alpha$-benzoyl-DL-arginine p-nitroanilide(BApNA)에 대한 기질 친화성은 4배 가량 높았다. 또한, BApNAse는 1 mM의 phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF)에 의해 90%나 크게 억제된 반면 aprotinin에 의해서는 크게 억제되지 않아 트립신과는 다른 serine proteinase로 판단되었으며, 효소활성은 Ca2+과 Mg2+에 의해 다소 증가하나 Mn2+, Hg2+, Zn2+에 의해 크게 억제되었다.

• 한국응용약물학회:학술대회논문집
• /
• 한국응용약물학회 1994년도 춘계학술대회 and 제3회 신약개발 연구발표회
• /
• pp.279-279
• /
• 1994

Fibrinolytic proteases, piscivorase I (PI) and piscivorase II (PII), were isolated from Agkistrodon piscivorus piscivorus (eastern cotonmouth moccasin) venom using gel filtration on Bio-Gel P100 and ion-exchange chromatography on CM-Sepharose. The molecular welghts of two proteases were approximately 23400 and 29000. Their isoelectric points 6.6 and 8.5, respectively. The partial amino acid sequences of PI were characterized by tryptic digestion. PI readily cleaves the A${\alpha}$-and B${\beta}$-chaln of fibronogen, but PII rapidly cleaves A${\alpha}$-chain and more slowly the B${\beta}$-chain, They were activated by Ca$\^$2+/, Mg$\^$2+/ and Ba$\^$2+/, but inhibited by Zn$\^$2+/, Cu$\^$2+/ and Mn$\^$2+/. Two enzymes were also inhibited by cysten, ${\beta}$-mercapto -ethanol, and by metal chelators such as EDTA and EGTA, but not by benzamidine, PMSF, soybean trypsin inhibitor and aprotinin. They did not act like thrombin, plasmin and kallikrein, using specific chromogenllc substrates. Two protease did not induce platelet aggregation. PI showed low hemorrhagic activity at dosage of 50 $\mu\textrm{g}$.