• 한국미생물·생명공학회지
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• 제35권3호
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• pp.184-190
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• 2007

대략 2 kb의 크기를 가진 Pichia pastoris phosphoglycerate kinase gene (PGK1)의 프로모터부분을 266bp의 작은 크기로 최소화하여 P. pastoris에 있어 episomal의 새로운 항시적 발현벡터를 제조하였다. P. pastoris의 새로운 항시적 발현벡터를 개발하기 위하여 기존의 Pichia발현벡터인 pGABZB의 GAP프로모터부분을 연속적으로 일정 부분이 절단된 PGK1프로모터에 beta-galactosidase유전자가 결합된 부분으로 치환하였다. LacZ유전자를 reporter유전자로 사용하였을 때에 PGK1프로모터의 발현세기는 다른 항시적 프로모터인 GAP프로모터 보다는 낮았지만 TEF1프로모터 보다는 높았다. 본 논문에서 PGK1 프로모터의 불필요한 부분을 제거함으로서 Pichia에서 외래발현을 위한 새로운 episomal발현벡터인 pPGKZ-E를 제조하였으며 이 것은 P. pastoris에 있어 발현세기를 선택할 수 있는 발현벡터선택의 폭을 넓게 하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제29권4호
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• pp.206-211
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• 2001

Klyyveromyces marxianus exoinulinase를 Saccharomyces cerevisiae에서 구성적으로 과발현 생산하기 위해, 구성적 promoter인 GAPDH, ADH1, PGK 및 ENOI promoters 하류에 exoinulinase 유전자 (INUI)의 ORF를 in frame으로 연결한 각각의 plasmi에 YIGP, pADHI,-INU, pPGK-INU 및 pENO-INU 를 구축하였다. 이들 각 plasmid를함유한 형질전환주 4종을 포도당 농도 5% 배지에서 회분배양한 결과 균체증식은 promoter에 따라 큰 차이를 보이지 않았지만 exoinulinase 발현수준과 plasmid 안정성은 사용한 promoter 에 크게 좌우되었다. 즉 exoinulinase 발현수준은 GAPDH PGK ADH1 ENO1 promoter 각각 1.70, 1.67 1.29, 0.80 unit/ml 였으며 plasmid 안정성은 GAPDH promoter 계의 55%를 제외하고 모두 80%이상으로 높게 나타났다. 이상의 plasmid 안정성과 exoinulinae 발현수준을 고려하여 ADH1 및 PGK 발현계를 선정하여 유가배양하였다 Yeast extract와 포도당을 간헐적으로 공급한 유가배양 결과, 두 발현계에서 약 30 g-DCW/1의 균체농도를 얻었지만, ADHI promoter 계에서는 3.70 unit/ml 의 최대 exoinulinase 활성과 96%의 plasmid 안정성을 보여TRh 반면에 PGK promoter 계는 각각 2.70 unit/ml/와 80%를 나타내었다. 따라서 plasmid 안정성과 긴 배양시간을 고려할 때 비선택적 영양배지를 사용하는 고농도세포 유가배양에서 ADH1 promoter가 exoinulinase 의 구성적 과발현, 생산에 더 적합할 것으로 사료된다.

• Journal of Animal Science and Technology
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• 제53권1호
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• pp.15-22
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• 2011

자돈의 생시 체중은 자돈의 이유 체중 및 생존율에도 크게 영향을 미친다. 또한 출하 시까지 돼지의 성장률 뿐만아니라 출하 일령 단축 및 출하 체중과도 밀접한 연관성이 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 돼지 7번 염색체의 PGK 2 (phosphoglycerate kinase 2) 유전자의 promoter 영역 및 transcription 영역에 해당하는 DNA 염기서열을 유전체 구조분석을 통해 20개의 SNP (Single Nucleotide Polymorpism)를 발굴하였고, 발굴된 SNP 중 PGK 2 유전자의 전사 조절 영역 내 g.122 T>G 다형을 재래돼지와 Landrace를 이용한 $F_2$ 집단 268두 자돈의 성장 형질과의 연관성 분석을 실시한 결과, 생시 체중(p<0.01) 및 3주령 체중(p<0.001)에서 통계적으로 고도의 유의적 연관성이 있음을 확인 할 수 있었다. 따라서 본 연구를 통하여 확인된 PGK 2 유전자의 promoter 영역 내 성장 형질 관련 SNP는 건강한 자돈 및 종돈을 조기 선발하기 위한 유전자 marker로 활용 가능성을 제시하였다.

• 미생물학회지
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• 제28권1호
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• pp.1-5
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• 1990

B형 간염바이러스($\alpha$dr 형)의 내면항원(HBcAg) 유전자는 두개의 단백질 합성시작 유전자 암호 ATG를 갖는다. 하나는 전위내 면항원을 다른 하나는 내면항원 유전자들 위한 ATG 부호이다. 내연항원의 발현과 전위내면항원의 역할을 연구한기 위하여 전위내면 항왼 유전자를 포함하는 것과 포함하지 않는 내연항원 유전자를 효모발현 운반체에 클j료녕 하였다. 또한 내면항원의 발현에 5 upstream 의 역할을 알아보기 위하여 여러 가지의 5’ 제거툴연변이체를 클로닝하였다. 앞에서 만들어진 플라스미드로 여러 효모 균주을 형질전환시킨 후 발헨된 내면항원과 그와 관련된 항원 HBeAg을 방사면역측정법 으로 확인하였다. 효모에서 내면항원 발현의 최적조건 허에서 가장 높은 수준의 항원은 PGK promoter 와 terminator에 내연향원 올 포함한 pGKHBc를 가진 SHY4에서 검출되었다. 전위내면부위의 존재와 우관하게 내면항원은 배양액에서는 검출되지 않고 세포내에서만 검출되었다. 이 결과는 전위내면항원이 효모 내에서 내연항왼의 분비에 영향올 주지않음을 의미한다.

• BMB Reports
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• 제29권4호
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• pp.359-364
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• 1996

By both in vitro hydroxylamine mutagenesis of the wild type 3-phosphoglycerate kinase gene (PGK) promoter DNA and insertion of the leu2-d gene, we have created yeast expression vectors potentially useful for production of eukaryotic genes in yeast. The guanine (G) to adenine (A) change at the -3 position from the ATG start codon of the PGK promoter-based vector rendered a 6~7 times elevated expression of the adjacent eukaryotic gene, and insertion of the leu2-d gene in the vector containing the mutated PGK promoter further enhanced the expression of the gene. When expression of the AIDS virus HIV1-gagP17 gene in a lacZ fusion form was examined with this new vector, a 15 times higher level of expression than that from the original PGK promoter was observed. Northern and Southern analysis showed that this elevated expression is due to the production of a high copy number of mRNA by leu2-d gene functioning and by efficient translation of the produced mRNA. Thus, the vector that contained the A at the -3 position from the ATG start codon in the promoter region and the leu2-d gene shows increased expression capability and will be potentially useful for production of eukaryotic genes in yeast.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제33권1호
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• pp.63-69
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• 2009

In this study we tried to construct a more efficient tetracycline-inducible gene expression system by replacing previous key elements with more advance ones. At the beginning, we substituted PGK (phophoglycerate kinase) promoter for CMV (cytomegalovirus) promoter to control "$rtTA2^sM2$" which has been known for high induction efficiency in response to tetracycline. With this modification, expression of the EGFP marker gene under the induction condition was significantly increased. Next, we replaced "TRE" fragment with a modified version named "TRE-tighf" which has been reported to have higher affinity and specificity to the transactivator by minor base change of the "TRE" DNA fragment sequence. Use of "TRE-tighf" instead of "TRE" resulted in more than 10 fold increment in terms of induction efficiency and significant decrement of background expression in non-inducible condition. By combining PGK promoter and "TRE-tight" fragment, we could upgrade previous tetracycline-inducible system to show more stringent turn on/off gene switch ability and stronger expression of the gene of our interest. Use of this newly developed system must be very helpful to the studies of gene expression, especially to the transgenic animal study in which non-controllable constitutive expression of the transgene has been one of the urgent problems to be solved.

• 한국동물학회지
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• 제39권1호
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• pp.75-88
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• 1996

OTF9-63 (OTF9)와 P19S1O1A1 (P19) 배종양 세포들의 체세포에 존재하는 불화성 X 염색체의 재활성과 유발 능력을 조사하였다. 배종야 세포와 체세포들의 융합에 의해 얻어진 HATr 클론들의 형태, 염색체 복제 양상을 비롯하여 X 염색체에 존재하나 그 위치는 상당히 먼 유전자들인 Hprt와 Pgk-1의 발현 양상을 분석한 결과, OTF9 세포는 불활성 X 염색체를 재활성화 시킬 수 있는데 반해 P19 세포는 불가능한 것으로 나타났다. 또한, 모든 유합세포는 장기간 배양되었을 때 성염색체의 수가 감소하였으며, 결국 1:2의 성염색체:상염색체의 비율을 나타내었다. 배종양 세포-체세포 융합세포의 이용은 초기 배발생 과정에서 시작되어 난자형성 과정의 감수분열 전까지의 유지되는 X 념색체의 재활성화 기작을 연구하기 위한 실험 방법을 제공한다.

• 한국응용약물학회:학술대회논문집
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• 한국응용약물학회 1994년도 제2회 추계심포지움
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• pp.147-172
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• 1994

Aziridinylbenzoquinones such as 3, 6-diaziridinyl-1, 4-benzoquinone (DZQ) and its 2, 5-methyl analog (MeDZQ) require bioreductive activation in order to elicit their anticancer activities. To determine the involvement of DTD in the activation of these drugs, we have used a ligation-mediated polymerase chain reaction to map the intracellular alkylation sites in a sing1e copy gene at the nucleotide level. We have performed this analysis in two human colon carcinoma cells, one proficient (HT-29) and one deficient (BE) in DT-diaphorase (DTD) activity. In the DTD proficient HT-29 cell line, DZQ and MeDZQ were found to alkylate both 5'-(A/T)G(C)-3' and 5'-(A/T)A-3' sequences. This is consistent with the nucleotide preferences observed when DZQ and MeDZQ are activated by purified DTD to reactive metabolites capable of alkylating DNA in vitro [Lee, C. -S., Hartley, J. A., Berardini, M. D., Butler, J., Siegel., D., Ross, D., & Gibson, N. W. (1992) Biochemistry, 31: 3019-3025]. Surprisingly in the DTD-deficient BE cell line a pattern of alkylation induced by DZQ and MeDZQ similar to that observed in the DTD-proficient HT-29 cells was observed. This suggests that reductive enzymes other than DTD can be involved in activating DZQ and MeDZQ to DNA reactive species in vivo.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제20권4호
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• pp.767-774
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• 2010

In this study, the problems of high caloric content, increased maturation time, and off-flavors in commercial beer manufacture arising from residual sugar, diacetyl, and acetaldehyde levels were addressed. A recombinant industrial brewing yeast strain (TQ1) was generated from T1 [Lipomyces starkeyi dextranase gene (LSD1) introduced, ${\alpha}$-acetohydroxyacid synthase gene (ILV2) disrupted] by introducing Saccharomyces cerevisiae glucoamylase (SGA1) and a strong promoter (PGK1), while disrupting the gene coding alcohol dehydrogenase (ADH2). The highest glucoamylase activity for TQ1 was 93.26 U/ml compared with host strain T1 (12.36 U/ml) and wild-type industrial yeast strain YSF5 (10.39 U/ml), respectively. European Brewery Convention (EBC) tube fermentation tests comparing the fermentation broths of TQ1 with T1 and YSF5 showed that the real extracts were reduced by 15.79% and 22.47%; the main residual maltotriose concentrations were reduced by 13.75% and 18.82%; the caloric contents were reduced by 27.18 and 35.39 calories per 12 oz. Owing to the disruption of the ADH2 gene in TQ1, the off-flavor acetaldehyde concentrations in the fermentation broth were 9.43% and 13.28%, respectively, lower than that of T1 and YSF5. No heterologous DNA sequences or drug resistance genes were introduced into TQ1. Hence, the gene manipulations in this work properly solved the addressed problems in commercial beer manufacture.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제19권8호
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• pp.823-828
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• 2009

An endo-${\beta}-1$,4-xylanase (${\beta}$-xylanase) from Trichoderma harzianum C4 was purified without cellulase activity by sequential chromatographies. The specific activity of the purified enzyme preparation was 430 units/mg protein on D-xylan. The complementary DNA (cDNA) encoding ${\beta}$-xylanase (xynII) was amplified by PCR and isolated from cDNA PCR libraries constructed from T. harzianum C4. The nucleotide sequence of the cDNA fragment contained an open reading frame of 663 bp that encodes 221 amino acids, of which the mature protein is homologous to several ${\beta}$-xylanases II. An intron of 63 bp was identified in the genomic DNA sequence of xynII. This gene was expressed in Saccharomyces cerevisiae strains under the control of adh1 (alcohol dehydrogenase I) and pgk1 (phosphoglycerate kinase I) promoters in 2 ${\mu}$-based plasmids, which could render recombinants able to secrete ${\beta}$-xylanase into the media.