• Reproductive and Developmental Biology
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• 제33권3호
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• pp.157-162
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• 2009

This study was performed to comprehend the developmental characteristics of cloned embryos knocked out (KO) of $\alpha$-1,3-galactosyltransferase (GalT) gene. Immature oocytes were collected and cultured for 40 hrs (1-step) or 20hrs (with hormone) + 20hrs (without hormone) (2-step). The embryos transferred with miniature pig ear fibroblast cell were used as control. The reconstructed embryos were cultured in PZM-3 with 5% $CO_2$ in air at $38.5^{\circ}C$ for 6 days. To determine the quality of the blstocysts, TUNEL and quantitative realtime RT-PCR were performed. The embryos were transferred to a surrogate (Landrace) at an earlier stage of the estrus cycle. The maturation rate was significantly higher in 2-step method than that of 1-step (p<0.05). The blastocyst development of GalT KO embryos was significantly lower than that of normal cloned embryos (p<0.05). The total and apoptotic cell number of GalT KO blastocysts was not different statistically from control. The relative abundance of Bax-$\alpha$/Bcl-xl ratio was significantly higher in both cloned blastocysts than that of in vivo blastocysts (p<0.05). Taken together, it can be postulated that the lower developmental potential and higher expression of apoptosis related genes in GalT KO SCNT embryos might be a cause of a low efficiency of GalT KO cloned miniature pig production.

• 한국균학회지
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• 제26권3호통권86호
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• pp.314-320
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• 1998

mRNA의 differential display방법에 의해 여름느타리 자실체의 상처 또는 자외선 처리시 발현되는 약 0.4kb의 cDNA 단편을 분리하였다. 이 cDNA 단편의 염기서열 분석결과 세포분열 촉진에 관여하는 cdc2-related protein kinase gene과 상당부분 유사성을 보였으며 RT-PCR 방법을 이용한 분리 유전자의 발현 실험을 통해 이 유전자가 정상 생장 환경에서는 갓, 대, 균사 등 모든 부위에서 기본적인 발현상태를 유지하고 있으며 기계적 상처 또는 자외선 처리에 의해 그 발현이 증폭됨을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 향후 분리된 유전자의 연구를 통한 버섯 병 방어 관련 신호 전달 체계 분석에 대한 가능성을 검토해 보았다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.60-60
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• 2001

Human thrombopoietin (hTPO) is a cytokine that plays a central role in megakaryopoiesis by influencing on the development and maturation of megakaryocyte and platelet production. To induce hTPO production in the mammary gland, expression vector was constructed by combining the promoter of bovine beta-casein gene, cDNA of hTPO and neomycine resistance gene for transfection into fibroblasts. Bovine fibroblast cells derived from female ear skin were transfercted with the expression vector using Lipofectamine (Life Technology, NY). Transected cells resistant to G4l8 treatment (600 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$) were recovered and colony formation was initiated at 13 days. The colonies with about 1 cm diameter were picked and analysed by PCR. Single transfected cells were individually transferred to enucleated oocytes. After electrofusion, the reconstructed embryos were exposed to calcium ionophore (5uM) for 5 min followed by treatment with 6-DMAP (2.5 mM) for 4h. The nuclear transfer embryos were cultured in CRlaa medium at 38.5C, 5% $CO_2$ for 7 days. Twenty three of 29 (79.3%) colonies were proved to be hTPO transfectants by PCR. The colonies were further passaged and used to produce transgenic embryos using nuclear transfer. Cleavage and developmental rates of reconstructed embryos to the blastocyst stage were 65.1% and 39.4%, respectively Of 22 blastocysts that developed from reconstructed embryos with the transfected cell, 20 embryos (90.9%) were positive for hTPO by using PCR analysis. The results suggest that somatic cell nuclear transfer is efficient for production of transgenic embryos.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제50권3호
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• pp.185-191
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• 2023

Objective: Although intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is a way to deal with in vitro fertilization failure, 3% of couples still experience repeated fertilization failure after attempted ICSI, despite having sperm within normal parameters. These patients are a challenging group whose sperm cannot fertilize the egg during ICSI. Unfortunately, no test can predict the risk of fertilization failure. Phospholipase C zeta (PLCζ) and transition nuclear proteins (TNPs) are essential factors for chromatin packaging during sperm maturation. This study aimed to assess PLCζ1 and TNP1 expression in the sperm of patients with fertilization failure and the correlations among the DNA fragmentation index, PLCζ1 and TNP1 gene and protein expression, and the risk of fertilization failure. Methods: In this study, 12 infertile couples with low fertilization rates (<25%) and complete failure of fertilization in their prior ICSI cycles despite normal sperm parameters were chosen as the case group. Fifteen individuals who underwent ICSI for the first time served as the control group. After sperm analysis and DNA fragmentation assays, quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot analyses were performed to compare the gene and protein expression of PLCζ and TNP1 in both groups. Results: DNA fragmentation was significantly higher in the fertilization failure group. The qRT-PCR and Western blot results demonstrated significantly lower PLCζ and TNP1 gene and protein expression in these patients than in controls. Conclusion: The present study showed that fertilization failure in normozoospermic men was probably due to deficient DNA packaging and expression of TNP1.

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권2호
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• pp.133-145
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• 2004

난자의 체외성숙 및 체외배양에는 일반적으로 동물의 혈청을 사용하고 있다. 그러나, 채취한 소의 상태에 따라서 혈청의 질에 차이가 있어 실험데이터가 일정하지 않을 수 있고, 그것으로부터 바이러스, 세균, 마이코플라즈마 등에 오염될 가능성이 있다. 따라서, 본 실험에서는 완전 무 혈청 배양액에서 난자의 성숙, 배 발생율, 세포 수, 동결성을 검토하였다. 다음으로, 근래 혈청배지로 생산한 체외 배양 수정란은 과체중의 산자 생산, 초기 산자 사망률, caesarean section, dystocia 같은 발병으로 문제가 지적되고 있다. 그러나 무 혈청 배지로 생산한 체외 배양 수정란은 이러한 현상을 개선할 수 있다는 보고가 있어 본 실험에서는 완전 무혈청 배양액에서 생산된 동결란과 신선란을 젖소에 이식하여 그 결과를 검토하였다. 무혈청 배양액에는 에너지원과 세포성장인자가 첨가된 IVD101과 IVMD101, 대조군인 혈청 배양액에는 TCM199 + 10% FBS가 사용되었다. IVMD101에 의해 체외성숙이 이루어 졌고, 혈청이 첨가된 TCM199 + 10% FBS에서는 12.4% 배 발생율을 보인데 반해, 무혈청 배양액 IVD101과 IVMD101이 각 32.4%, 34.5%로 훨씬 높은 배 발생율을 보였다. 더욱이, 세포 수에 있어서도 무혈청 배양액에서 발생된 배반포의 세포수가 혈청이 첨가된 배양액에서 발생된 배반포의 세포수보다 월등하였으며, 이는 체내란과 비슷한 세포 수를 보이고 있다. 수정란의 내동성을 보면, 융해하고 24시간 배양기 정치 후에 IVD101과 IVMD101은 94.5%, 95.8%의 생존율을 보인 반면 TCM199 + 10% FBS는 52.5%에 불과하다. 융해하고 72시간후 탈출 배반포율이 IVD101과 IVMD101는 78.4%, 83.7%였는데 반해 TCM199 + 10% FBS는 32.0%였다. 마지막으로, 무혈청 배양액에서 발생한 동결란과 신선란을 젖소에 이식한 후에 임신율에 있어서는 유의적 차이는 없었지만, 무혈청 배지에서 생산된 수정란의 내동성의 탁월함이 증명되었다. 이러한 결과들로 종합해 보면, 무혈청 배양액 (IVD101, IVMD101)에서 발생된 수정란이 혈청 배양액에서 발생된 수정란보다 배발생율, 세포수, 동결성, 임신율에 있어서 우수함을 알 수 있었다. 이러한 무혈청 배양액은 배발생 과정의 연구뿐만 아니라 수정란 이식을 위한 고품질의 체외 수정란의 대량 생산, 복제, 형질전환 동물 생산 등에도 유익할 것으로 사료된다.

• 한국양식학회지
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• 제19권4호
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• pp.267-274
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• 2006

자연산(silver 및 yellow) 뱀장어의 인위적인 성성숙 과정중에 체중 및 혈중 성호르몬 농도를 조사하기 위해 연어 뇌하수체 추출물(SPE; 20 mg pituitary powder/fish)를 Freund's incomplete adjuvant로 water-in oil (W/O) 형태로 유화시켜 매주 복강에 주사하였다. Eel's Ringer액만으로 유화시켜 주사한 대조구(silver 및 yellow) 뱀장어의 경우, 체중은 서서히 감소하는 경향을 나타내었으며, 혈중 성호르몬(testosterone; T, $estradiol-17{\beta};\;E_2$ 및 $17{\alpha},20{\beta}-dihydroxyprogesterone$; DHP)의 농도도 실험기간 동안 거의 변화없이 서서히 감소하는 경향을 나타냈었지만 유의적인 변화는 없었다. 한편, 매주 SPE로 주사한 silver 뱀장어는 투여 6주후부터 급격한 체중변화가 일어났으며, 대부분 개체의 난모세포는 핵이동기로 구성되어져 있었다. 또한 혈중 T와 $E_2$ 농도의 두드러진 증가는 투여 6주후부터 관찰되어 졌다. 매주 SPE로 주사한 yellow 뱀장어의 경우, 대부분 개체는 투여 5주까지 체중 변화가 완만하게 나타났으며 그 이후 급속히 증가하였다. 이들 개체의 대부분은 실험종료시에도 제3 난황구기의 난모세포들로 구성되어져 있었다. 특히 실험 기간중 혈중 T와 $E_2$ 농도는 개체별로 다양하게 나타났으며, 유의한 차이는 제각기 투여 8주째와 투여 6주 후 부터 두드러지게 증가하였다. 그러나 매주 SPE로 주사한 자연산 뱀장어(silver 및 yellow)의 혈중 DHP 농도는 실험 기간동안 불검출 혹은 매우 낮은 농도로 유지하였으며, 유의적인 변화는 관찰되지 않았다. 본 연구의 결과, sliver 뱀장어에 있어서 SPE를 W/O 형태로 유화시켜 반복 투여함으로써 체중 및 혈중 성호르몬(T와 $E_2$)의 급격한 증가 및 최종성숙을 유도하는데 효과적이었다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제33권3호
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• pp.189-198
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• 2006

목적: 본 연구진은 난자성숙 과정의 조절 기작을 규명하기 위하여 생쥐의 미성숙 난자와 성숙난자에서 차이 나게 발현하는 유전자의 목록을 얻은 바 있다. 이들 유전자 중에서 Bcl-2 homolog인 Diva 유전자가 난자에 특이적으로 발현함을 본 연구를 통해 규명하였는데 이러한 Diva의 기능을 밝혀내기 위하여 immunoprecipitation (IP)과 Mass Spectrometry (MS)를 이용하여 Diva와 결합하여 상호작용하는 단백질을 동정하고자 하였다. 연구방법: NIH/3T3 세포주에 Diva를 encoding하는 pCMV-FLAG-Diva를 24 시간 동안 과발현 시키고 대조군으로는 유전자 없는 pCMV-FLAG empty vector를 transfection 하였다. FLAG에 특이적인 항체로 IP하여 Diva와 결합하는 면역복합체를 형성하게 한 후 이를 12% SDS-polyacrylamide gel 상에서 전기 영동하였고 Coomassie Blue 염색을 통해 단백질 발현양상을 관찰하였다. 대조군에서는 관찰되지 않으면서 Diva 유전자가 발현하는 실험군에서만 확인되는 밴드를 오려내어 trypsin을 사용하여 in-gel digestion 한 후 MS 분석을 시행하였다. 모든 mass spectra는 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems, Framingham, MA)에 의해 positive reflector mode에서 얻어졌다. 이렇게 얻어진 단백질들은 MASCOT Peptide Mass Fingerprint software (Matrixscience, London)을 이용하여 NCBI nonredundant database를 찾아서 동정하였다. 결과: Diva를 과발현하는 세포주에서만 관찰되는 15개 밴드에 대한 MS/MS 분석 결과, Diva와 결합하는 단백질로서 actin과 그 외에 ${\alpha}$-actinin, tropomyosin, tropomodulin 3 등의 actin-binding 단백질을 동정하였다. Diva를 과발현하는 NIH/3T3 세포주에서 면역 복합체를 형성하는 actin과 tropomyosin이 실제 난소 조직에서도 Diva와 결합하는지 IP와 Western blot을 통해 확인한 결과, actin과 tropomyosin 모두 Diva와 결합함을 확인함으로써, Diva는 이 두 단백질과 난소에서 상호작용함을 알 수 있었다. 결론: 본 연구는 Diva와 결합하여 상호작용하는 단백질들이 cytoskeletal system의 actin filament와 관계 있음을 규명한 최초의 보고이다. Diva가 actin과 tropomyosin과 결합하는 것을 고려해볼때, 난자 특이적인 Diva는 아마도 난자성숙 동안에 cytoskeletal system 을 조절하는 역할을 할 것으로 사료된다.

• 한국양식학회지
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• 제8권3호
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• pp.171-181
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• 1995

붕어의 년 생식주기를 밝히기 위해 1993년 2월부터 1994년 10월까지 gonadosomatic index (GSI)를 조사하였다. GSI는 4월부터 7월까지는 높은 수준을 나타내며 개체간에 편차가 큰 것으로 보아 이 기간이 산란기임을 보여준다. 8월부터 9월까지는 년중에서 가장 낮은 수준이며 이때 난소내 여포는 퇴화가 진행 중이었다 10월부터 GSI 값은 증가하여 이듬해 3월에 최대치를 보였다. Human chorionic gonadotropin (HCG 10 lU), $17\alpha$, 20\beta-dihydroxyprogesterone\;(1-100{\mu}g/ml)$ 및 phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA, protein kinase C activator, 0.1-10${\mu}M$)는 인공배양 시 난모세포의 성숙을 유도하였으나 $4\alpha-phorbol$ 12, 13-didicanoate ($4\alpha-PDD$, phorbol ester analogue, $(25{\mu}M$)는 성숙을 일으키지 않았다. 또한, HCG (10 IU), prostaglandin $F_{2\alpha}$ (0.1-10${\mu}g/ml$) 및 TPA (0.1-10${\mu}M$)는 난모세포의 배란을 유도하였으나 $4\alpha-PDD$$(25\;{\mu}M)$에 의해서는 배란이 일어나지 않았다. 여포세포의 $17\alpha-hydroxyprogesterone$은 HCG (1 IU, 10 IU) 및 forskolin (adenylate cyclase activator, 0.1-10 ${\mu}M$)에 의해 생성이 촉진되었으며 HCG (10 IU) 및 forskolin $(10 {\mu}M)$에 의한 time course 는 3시간 내에 생성량이 증가하여 시간경과에 따른 유의한 차이는 보이지 않았다. 이러한 결과를 종합하면 cyclic AMP와 protein kinase C 는 어류의 난모세포의 성숙과 배란과정에 매우 중요한 역할을 담당하는 것으로 생각된다.

• 한국수산과학회지
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• 제22권5호
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• pp.266-280
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• 1989

1987년 1월부터 1988년 12월까지 2년간 제주도 서남해역 및 동지나해역에서 어획된 덕대, Pampus echinogaster와 병어, Pampus argenteus를 부산공동어시장에서 구입하여 성성숙 및 생식주기를 조사한 결과는 다음과 같다. 1. 덕대와 병어의 생식소의 외부형태 및 구조는 암$\cdot$수 모두 좌우비상칭이며 난소는 낭상형, 정소는 엽상형 이다. 2. 생식소숙도지수는 덕대는 3월부터 증가하여 $5\~6$월에 최대치를 나타내고 이후 감소하여 8월부터 이듬해 2월까지는 연중 낮은 값을 나타내었다. 병어도 연중경향은 유사하였으나 다만 4월에 덕대에 비하여 높은 값을 나타냈다. 3. 간숙도지수는 생식소숙도지수와 비례적으로 변화하여 덕대의 경우 $4\~6$월, 병어는 $4\~8$월에 높게 나타났다. 4. 비만도값은 덕대와 병어 모두 생식시기인 하계에 낮았고, 휴지기인 동계에 높게 나타났다. 5. 난소는 2월부터 난소소낭상피에서 $100\mu$전후의 초기난모세포들이 활발히 성장하며, $3\~4$월에는 이들 난모세포들의 세포질속 난황구가 축적되면서 $400\~500\mu$크기의 성숙난모세포로 된다. 5월 이후부터는 $650\~850\mu$크기의 완숙난모세포로 되어 방란되기 시작하고 소수의 미방출 완숙란들은 자체퇴화흡수된다. 정소 역시 2월부터 정소소엽상피에서 활발히 분열증식된 정원세포들이 정모세포로성장하며, 5월을 전후로 소엽내강에 변태된 정자들이 출현한다. 방정후 정소소엽상피는 비후되고 잔존정자들이 퇴화흡수된다. 6. 덕대와 병어는 거의 유사한 연속된 생식주기를 나타냈는데 즉 성장기 (3월$\~$4월), 성숙기 (4월$\~$5월), 완숙 및 방란기($6\~7$월), 회복 및 휴지기(8월$\~$1월)로 구분할 수 있었다. 7 한 산란기동안 덕대는 2회 이상을, 병어는 3회 이상을 산란하는 다회산란종이다. 덕대의 절대포란수는 최대 135,294개, 최소 9,441개로 나타났으며, 병어는 18.6cm 이상의 체장에서 최대 221,894개, 최소 50,678개로 나타났다. 덕대와 병어의 절대포란수는 체장과 전중에 비례하여 증가하고 상대포란수는 체장에 비례, 전중에 반비례하였다. 8. 덕대의 $50\%$ 군성숙체장은 암컷에서는 체장 15.40cm, 수컷은 12.47cm 이상이었고, $100\%$ 군성숙 체장은 암컷은 18.0cm 이상, 수컷은 21.0cm 이상이었다. 그리고 덕대의 생물학적최소형은 암컷은 체장 9.87cm, 수컷은 9.65cm이었다. 병어는 채집된 최소체장인 암컷 18.6cm, 수컷 16.7cm 이상에서 $100\%$ 전개체가 재생산에 참여하였다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제21권1호
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• pp.21-27
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• 2006

고양이의 연령에 따른 난포의 분포를 알아보고 난포의 배양과 난자 생산의 가능성을 알아보고자 0.3세부터 5세까지의 총 41 마리 고양이를 난소 적출술 후 사용하였다. 고양이 난소의 무게와 크기를 측정하고 난포의 분포를 알아보기 위해 난소를 10% formalin에 보관한 후 고정된 난소를 $3{\mu}m$-sections으로 자른 후 조직 슬라이드를 준비하여 hematoxylin와 eosin으로 염색하였다. 난포의 분포를 200 배율와 400 배율 현미경하에서 평가하였으며 난포를 원시 난포(primordial), 일차 난포(primary), 이행성 난포(transitional), 전동난포(preantral), 동난포(antral)로 분류하여 관찰하였다. 단순 기계적인 방법에 의해 전동난포(preantral follicles)를 분리하여 배양배지가 담긴 96 microliter plates well로 옮겨 배양하였다. 난포의 배양액은 Medium 199에 1% ITS(insulin, transferrin, selenium)를 첨가하고 10% FBS나 10% PVA를 첨가하여 사용하였으며 배양배지위에 mineral oil를 덮고 16일 동안 난포를 배양하였다. 난포의 크기는 4일마다 측정하였다. 0.3세부터 5세까지 고양이 난소의 무게는 0.1g에서 0.3g으로 증가하는 양상을 보이기는 했으나 유의적인 차이가 없었다. 난포의 분포는 고양이의 연령에 관계없이 원시난포의 분포가 그 외 난포들의 분포보다 높게 나타났다(p<0.05). 난포를 4일 이상 배양하였을 때 배양액의 조성성분과 관계없이 난포의 크기가 감소하였으며, 체외 배양된 난포로부터 적은 수의 난자만을 회수할 수 있었다. 많은 수의 원시 난포 등을 분리하기 위한 유용한 난포 분리법과 난포의 배양에 필요한 기타 성분들의 비교 연구가 이루어져야 할 것으로 생각되며 이러한 집 고양이를 이용한 기초 번식 기술은 미래에 멸종위기에 처한 고양이 과 동물을 보존하기 위한 중요한 방법이 될 것으로 기대된다.