The histochemical, cytochemical, and immunocytochemical investigations were conducted to find out the cellulase activity in the accessory glands of the digestive system of the oriental land snail Nesiohelix samarangae under the LM, SEM, and TEM. The cellulase activity was shown in the epithelium of th digestive gland by labelling with the immunogold (protein-A gold) particles. The epithelial cells showing the cellulase activity were Type 1 and Type 3 cells out of five types of the epithelial cells of the digestive gland. None of epithelial cells of the mucus gland and the salivary gland and the salivary gland were not labeled with the immunogold particles.
Histochemical, cytochemical, and immmunocytochemical investigations were conducted to find out the cellulase activities in the accessory glands of the digestive system in the oriental land snail Nesiohelix samarangae under the LM, SEM, and TEM. It was found that the Type 1 and Type 3 cells out of five types of the epithelial cells of the digestive gland were labeled with the immunogold(protein-A gold) particles. Otherwise, none of epithelial cells of the mucus gland and the salivary gland were not labeled with the immunogold particles.
In order to observe the anticellulolytic localization in the epithelia of the digestive tract such as esophagus, crop, and intestine of a Korean land snail N. samarangae, a cytochemical method and a immunogold labelling method were applied. For the cytochemical study on the cellulase activity, Benedict reaction method applied. And for the immunocytochemical study, the rabbit serum immunoglobuins (IgG) was obtained from the rabbits injected with cellulase which was extracted from body fluid of the snail. The digestive tract tissues of N. samarangae were fixed with 4% paraformaldehyde and 2% OsO4 and embedded in Lowicryl K4M at -40$^{\circ}C$ under UV light (360 nm). The thin sections were loaded on the nickel grids and stained with the serum IgG and protein A-gold complex (particle size: 10 nm). Observations were undertaken with transmission electron microscope (Jeol, JEM-1010). The epithelium of the digestive tract was consisted of five types of cells. In the cytochemical study, the reaction products were found along the periphery of the vacuoles derived from the Bebedict reaction. In the immunocytochemical study, the protein-A gold particles were selectively labelled in Type 1, Type 3 and Type 4 cells in intestinal tissue. membranes of rER, in the surrounding cytoplasm of the rER and secretory granules, and in the apical cytoplasm of the cells. On the material being secreted from the apical cytoplasm was also labelled with the immunogold particles. The all results obtained throughtout present study suggest that the intestinal epithelium of the snail N. samarangae seretes cellulase as one of digestive enzymes.
동양달팽이 (Nesiohelix samarangae)는 동양달팽이속(Nesiohelix)에 속하는 종으로 한국에서 동양?팽이속으로는 유일하게 발견되는 종이다. 본 실험에서는 동양달팽이의 웅성생식기관의 각 부분 즉, 난정소(ovotestis), 양성관(hermaphrodite duct), 수정실(fertilization chamber), 전립선(prostate), 수정관(vas deferens), 상음경(epiphallus), 음경(penis)등의 배열 상태를 관찰하고 이들에 대한 광학현미경적 관찰을 위해 Hematoxylin- Eosin염색과 Mallory 염색을 실시하였다. 난정소(ovotestis)는 많은 수의 선포(acini)로 이루어져 있으며 각 선포는 배상피세포층(germinal epithelial cell layer)과 영양세포(nurse cell), 생식세포(gamete cell)들로 이루어져 있었다. 선포(acini)는 원주상피로 덮여있었다. 양성관(hermaphrodite duct)은 가늘고 긴 관으로 내벽은 섬모입방상피세포와 얇은 결합조직층으로 이루어져 있었으며 내강은 농축된 정자로 가득 차 있었다 . 수정관(fertilization chamber)은 3개의 도관이 결합조직에 의해 둘러싸인 형태로 이루어져 있었다. 도관의 상피세포는 뚜렷한 위중층섬모원주세포로 되어 있었다. 전립선(prostaoe)은 분비기능을 가진 것으로 사료되는 세포들과 실제 분비가 일어나는 실(chamber)로 이루어져 있었으나 다른 염색법 또는 전자현미경적 관찰에 의해 다른 구조들의 존재유무를 확인 해야할 것으로 사료된다. 실(chamber)은 분비포로 보이는 세포들과 접해 있었다. 수정관(vas deferens)은 결합조직으로 이루어진 근육질의 두꺼운 벽을 가지고 있었으며 내강은 돌출부위에 의해 4부분으로 갈라져 있었다. 내강에 연한 상피는 원주세포로 되어 있었다. 상음경(epiphallus)의 벽은 근섬유 다발은 벽의 외곽으로 갈수록 밀도가 높아졌다. 상부에 내강과 연결되는 함입구조(groove)를 가지며, 내강에 연한 상피는 섬모가 없는 원주세포로 이루어져 있었다. 음경(penis)은 근섬유가 산재된 두꺼운 벽을 가졌으며 상음경보다 굵은 원통형이었다. 내강은 많은 돌출부에 의해 복잡하게 나뉘어 있으며 상피세포는 원주 세포로 이루어져 있었고 섬모는 관찰되지 않았다. 내강 내의 분비물과 세포의 형태로 보아 내강상피세포는 분비기능을 가진 것으로 사료된다.
동양달팽이의 EST 에서 serpin 유전자는 2가지 type이 추정되었다. Ns-serpin type 1 (partial) 서열의 코딩 영역은 총 819 bp 이었으며, 272개의 아미노산으로 이루어져 있었으며, Ns-serpin type 2 (partial) 의 코딩영역은 총 555 bp, 185개의 아미노산으로 이루어져 있었다. Laminarin 처리 전에는 Ns-serpin type 1이 2개 발현되었으며 처리 후에는 Ns-serpin type 2가 1개 발현되고 있었다. BLAST 결과를 바탕으로 유사도가 높은 17개의 참고 서열과 동양달팽이의 Ns-serpin type 1, 2의 아미노산 서열을 MEGA6 프로그램의 clustalW 엔진을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행한 결과, 척색동물의 포유강 9종, 조류강 1종, 양서강 1종과 척색동물인 해초강, 절지동물의 거미강 1종과 곤충강 1종이 같은 군으로 묶였으며, 연체동물문의 경우 동양달팽이의 두 가지 type 을 포함한 복족강 4종이 같은 군으로 묶이는 것을 확인하였다. Psipred 프로그램을 활용하여 예측한 2D 구조도 multiple align 및 phylodendrogram 결과와 연관이 있음을 확인할 수 있었다. EST를 통해 밝힌 동양달팽이의 두 가지 type의 Ns-serpin 서열은 Aplysia californica 등의 근연종들의 서열과 유사하였다. 본 연구에서는 무척추동물에서의 선천성 면역과 연관이 있는 것으로 잘 알려진 두 종류의 serpin 유전자 서열을 동양달팽이 EST 결과에서 발굴 하였으며, 동양달팽이에서도 여러 가지 type의 serpin 이 존재 할 수 있음을 입증하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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