• 한국양식학회지
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• 제10권1호
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• pp.33-37
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• 1997

미꾸라지를 대상으로 어류 유전자 이식을 위한 유용 model system으로 개발하기 위한 연구의 일환으로 잉어의$\beta$-actin 유전자의 promoter와 CAT 유전자가 융합되어 있는 외래 유전자 (pFV4CAT)를 미꾸라지에 이식, transgenic founder 미꾸라지를 생산하였다. PCR 분석결과, 이식된 외래 유전자는 부화 후 9개월된 성어에서 7.4-37.0%의 빈도로 존재하였으며 Southern blot 분석에 의해서 염색체 상의 삽입 가능성을 나타내었다. In situ immunohistochemical analysis 결과 이식된 외래 유전자는 미꾸라지 세포내에서 비교적 높은 빈도로 발현하였으며 그 발현 양상은 개체마다 다양하게 나타났다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제32권3호
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• pp.81-86
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• 2017

The Somatic cell nuclear transfer (SCNT) method can be applied to various fields such as species conservation, regenerative medicine, farming industries and drug production. However, the efficiency using SCNT is very low for many reasons. One of the troubles of SCNT is that it is highly dependent on the researcher's competence. For that reason, four somatic cell nuclear injection methods were compared to evaluate the effect of hole-sealing process and existence of cytochalasin B (CB) on efficiency of murine SCNT protocol. As a results, the microinjection with the hole-sealing process, the oocyte plasma membrane is inhaled with injection pipette, in HCZB with CB was presented to be the most efficient for the reconstructed in SCNT process. In addition, we demonstrated that the oocytes manipulated in Hepes-CZB medium (HCZB) with CB does not affect the developmental rate and the morphology of the blastocyst during the pre-implantation stage. For this reason, we suggest the microinjection involving hole-sealing in HCZB with CB could improve SCNT process efficiency.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제23권1호
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• pp.55-61
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• 2019

To develop a promoter capable of driving transgene expression in non-model fish, we identified and characterized the muscle-specific alpha-actin gene in olive flounder, Paralichthys olivaceus (PoACTC1). The regulatory region of PoACTC1 includes putative regulatory elements such as a TATA box, two MyoD binding sites, three CArG boxes, and a CCAAT box. Microinjection experiments demonstrated that the regulatory region of PoACTC1, covering from -2,126 bp to +751 bp, just prior to the start codon, drove the expression of red fluorescent protein in developing zebrafish embryos and hatching olive flounder. These results suggest that the regulatory region of PoACTC1 may be useful in developing a promoter for biotechnological applications such as transgene expression in olive flounder.

• 한국가축번식학회지
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• 제20권1호
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• pp.19-26
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• 1996

본 연구는 체외에서 생산된 돼지수정란에 외래유전자를 미세주입후 체외 배 발달과 유전자 발현을 조사하기 위하여 실시하였다. 체외수정후 18∼20 시간 사이에 LacZ 유전자와 산양 성장호르몬 유전자를 미세주입하였으며, 체외 배 발달율과 유전자 발현은 미세주입후 9일간 체외배양을 실시한 다음 조사하였다. 돼지수정란을 원심분리하여 전핵을 관찰한 결과 60.3%의 난자에서 전핵이 가시화되었다. 또한 유전자가 미세주입된 수정란중 상실배와 배반포까지 발달한 비율은 각각 8.6, 9.1%로 대조구의 발달율 19.0, 20.8%보다 유의하게 낮았다. 그러나, NCSU23 배양액에 4일간 배양후 EMEM 배양액으로 교체하여 배양한 결과, 배반포 및 부화배반포까지 높은 발달율(19.4%)을 나타내었다. X-gal 염색의 결과로서, LacZ의 발현을 나타낸 수정란의 비율은 상살배, 배반포 단계에서 40.0, 42.9%로 나타났으나, 이들 형질전환 수정란의 대부분은 mosaic 현상이 관찰되었다. 또한 PCR 부분에서, gGH 유전자가 도입된 수정란의 비율은 상실배, 배반포단계에서 45.0, 44.4%로 X-gal 염색의 결과와 유의한 차이가 없었다. 따라서 본 실험에서 얻어진 결과들은 체외에서 생산된 돼지수정란은 미세주입후에도 배반포 및 부화배반포까지 성공적으로 발달할 수 있다는 것을 입증하였다. 또한 체외성숙, 수정된 돼지수정란을 이용하여 형질전환 돼지 생산의 가능성을 시사하고 있다.

• 생명과학회지
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• 제27권6호
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• pp.617-622
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• 2017

본 연구에서는 zebrafish에 사람의 cyt $b_5$ 유전자를 microinjection하여 발현시키고, 그 결과를 형광으로 확인하였다. HeLa cell에서 RT-PCR을 진행한 결과 414 bp의 cyt $b_5$ band가 증폭되었다. 염기서열 분석으로 재확인된 cyt $b_5$ insert를 pEGFP-N3의 형광 vector에 클로닝하였고, 이렇게 준비된 pEGFP-N3-cyt $b_5$ plasmid DNA를 1세 포기의 수정란에 microinjection하였다. cyt $b_5$를 microinjection한 치어를 형광현미경으로 관찰한 결과 대조군 치어보다 훨씬 선명한 형광을 띠는 것이 확인되었다. 최종적으로 치어에서 RNA를 분리하여 RT-PCR하였고 전기영동과 DNA sequencing으로 fusion 단백질의 발현을 재확인하였다. Cyt $b_5$의 발현으로 인해 zebrafish의 생존율이 다소 떨어지는 것으로 확인되었기에 독성 문제를 해결하기 위한 연구가 계속 필요할 것으로 사료된다. 이 연구는 향후 cyt $b_5$가 결핍되었을 경우 발생할 수 있는 여러 질병들을 유전자 차원에서 치료하고, 유용 유전자 클로닝을 위한 기술 개발에 발판이 될 수 있을 것으로 기대된다.

• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
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• 한국수정란이식학회 2002년도 국제심포지엄
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• pp.69-69
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• 2002

Transgenic animals production tools have been valuable for research and purpose. The current methods of gene transfer, microinjection and nuclear transfer, which are widely used in transgenic animal production, but all most methods has only had limited success in production of larger species. Here, we report the possibility of a sperm-mediated gene transfer method in porcine embryos. Oocytes were collected from ovaries harvested at a local slaughterhouse were matured in 500${mu}ell$ drops of TCM-199 under mineral oil at 38.5$^{\circ}C$ in a humidified atmosphere of 5%CO2 in air. After 42-43h of in vitro maturation oocytes were denuded. for sperm injection into the cytoplasm of the porcine oocytes, sperm suspension in NIM medium are subjected extraction with TritonX-100 before mixing with a green fluorescent gene (GFP). Sperm with Tritonx-100 were prepared by adding TritonX-100 to a final volume of 0.05% in the sperm suspension and mixing by trituration for 60s before two wishes in NIM medium at 2$^{\circ}C$. A(ter wishing, sperm were mixed with TritonX-100 at $25^{\circ}C$ followed by washes at 2$^{\circ}C$. Sperm were resuspended in ice cold NIM to a final volume of 400${mu}ell$ and 2-20ng/${mu}ell$ DNA were triturated on ice for 60s. All microinjection was performed in HEPES-buffered CZB medium at room temperature within 2h. After culture in NCSU-23 for 72h, percent of porcine embryos transfected GFP gene are 20.7%(6/29) in 20ng/${mu}ell$ sperm-DNA mixed group and other groups were 3.7 %(2/54)and 4.7%(3/67). These data suggests that sperm-mediated gene transfer method should be used to the production tool of transgenic pig efficiently.

• The Korean Journal of Physiology and Pharmacology
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• 제19권5호
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• pp.427-434
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• 2015

Significant evidence supports the role of the vestibular system in the regulation of blood pressure during postural movements. In the present study, the role of the vestibulo-spino-adrenal (VSA) axis in the modulation of blood pressure via the vestibulosympathetic reflex was clarified by immunohistochemical and enzyme immunoassay methods in conscious rats with sinoaortic denervation. Expression of c-Fos protein in the intermediolateral cell column of the middle thoracic spinal regions and blood epinephrine levels were investigated, following microinjection of glutamate receptor agonists or antagonists into the medial vestibular nucleus (MVN) and/or sodium nitroprusside (SNP)-induced hypotension. Both microinjection of glutamate receptor agonists (NMDA and AMPA) into the MVN or rostral ventrolateral medullary nucleus (RVLM) and SNP-induced hypotension led to increased number of c-Fos positive neurons in the intermediolateral cell column of the middle thoracic spinal regions and increased blood epinephrine levels. Pretreatment with microinjection of glutamate receptor antagonists (MK-801 and CNQX) into the MVN or RVLM prevented the increased number of c-Fos positive neurons resulting from SNP-induced hypotension, and reversed the increased blood epinephrine levels. These results indicate that the VSA axis may be a key component of the pathway used by the vestibulosympathetic reflex to maintain blood pressure during postural movements.

• 한국수정란이식학회지
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• 제30권3호
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• pp.207-211
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• 2015

미세주입법에 의한 형질전환 마우스 제작에는 대량의 전핵기란을 필요로 한다. 본 실험에서는 심플한 형질전환 마우스 제작방법을 확립하기 위해 초급속 동결한 전핵기란을 공시했다. 초급속 동결법으로 동결한 전핵기 체외수정란 139개를 융해 후 공시하고, ${\beta}-actin/luc^+$ 융합유전자를 미세주입하였다. 주입 조작 후, 형태학적으로 정상적인 수정란 101개(72.6%)를 5마리의 수란암컷 마우스에 이식하였다. 그 결과, 이식한 모든 마우스가 임신하고, 최종적으로 15마리(14.8%)의 산자가 태어났다. 한편, 450개의 체외수정란에 대해 동일한 배아조작 후에 338개(75.1%)가 생존하고 14마리의 수란암컷 마우스에 이식 하였다. 그 중에 78%의 수정암컷 마우스가 임신하고, 54마리(19.1%)의 산자가 태어났다. 태어난 산자에 대해서는 southern blot 법에 의해 염색체 내의 도입유전자의 도입을 확인한 결과, 동결수정란 처리구와 체외수정란구에서 각각 6.6%(1/15), 5.5% (3/54)의 마우스에서 도입유전자의 도입이 확인되었다. 더욱이 두 처리구 전부의 형질전환 마우스의 미부조직에서 도입유전자인 루시페라제 유전자의 발현이 관찰되었다. 이상의 결과에 의해 체외수정란 초급속 동결보존법을 사용한 Tg 마우스 제작방법의 확립을 확인하였고, 이러한 결과들로부터 실험기간의 단축과 작업의 간소화에 크게 이바지할 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권3호
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• pp.237-242
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• 2001

본 실험실에서는 최근에 SINE계 B$_1$과 B$_2$의 융합서열이 리포터유전자의 게놈내 삽입을 증가 시킴을 증명하는 결과를 보고하였다. Supercoil 형태일 때 대조구가 6%, SINE 벡터가 25%, 그리고 linear 형태일 때 각각 16%와 63%로 나타났다. 이번 실험에서는 이들 두가지 형태의 벡터를 같은 양으로 혼합한 DNA를 미세주입에 응용함으로서, 전체 게놈내 삽입률 중에서 과연 supercoil 형태의 벡터가 어느 정도로 기여하는지를 조사하였다. 수정란의 전핵에 혼합형태의 DNA를 미세주입한 후 배반포기의 생쥐배아를 대상으로 베타-갈락토시데아제 발현 여부를 조사한 결과 대조구의 경우 17.3%, SINE계 벡터의 경우 46.6%가 양성을 나타내었다. 이 결과는 아마도 supercoil 형태의 벡터는 독자적인 삽입 경로를 가지지 않음을 의미하는 것이며, 대부분의 경우 외래 유전자의 삽입은 linear 형태로 삽입이 이루어지는 듯 하다. 부가적으로 미세주입 결과로부터 일부 삽입 기작을 짐작할 수 있는 결과를 얻을 수 있었다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2002년도 춘계학술발표대회 발표논문초록집
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• pp.58-58
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• 2002

Currently, the technique of pronuclear microinjection is the most successful and most widely-used method for producing transgenic animals. Among this technique, surperovulation and embryo transfer are the crucial steps for obtaining a large number of fertilized eggs and birth as much as potential founders from the transferred embryos. (omitted)