• 한국가축번식학회지
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• 제16권3호
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• pp.239-246
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• 1992

미성숙 나포란을 20% FCS가 첨가된 TCM-199으로써 24시간 동안 5% CO2, 8% O2의 공기 조건하에서 체외성숙시킨 다음 난자의 위란강내로 정자를 미세주입하여 체외수정을 실시하였다. 미세주입 하기전 정액을 0.75% BSA가 첨가된 Ham's F-10 배양액으로 2시간 동안 5% CO2, 8% O2의 공기 조건하에서 배양함으로써 수정능 획득을 하도록하였으며 이어 30분 동안 12mM의 dbcGMP와 10mM의 imidazol이 함유된 Ham's F-10 배양액으로 배양함으로써 첨체반응을 유도하였다. 본 실험에서 정자의 미세주입 후 제 2극체와 전핵형성이 일어난 난자의 비율은 각각 9.5, 5.4%였으며 2세포기 이후로 발달한 난자의 비율은 4.1%이었다.

• The Korean Journal of Physiology and Pharmacology
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• 제1권6호
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• pp.603-611
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• 1997

The motor evoked potentials (MEPs) have been advocated as a method of monitoring the integrity of spinal efferent pathways in various injury models of the central nervous system. However, there were many disputes about origin sites of MEPs generated by transcranial electrical stimulation. The purpose of present study was to investigate the effect of major extrapyramidal motor nuclei such as lateral vestibular nucleus (VN) and medullary reticular nucleus (mRTN) on any components of the MEPs in adult Sprague-Dalwey rats. MEPs were evoked by electrical stimulation of the right sensorimotor cortex through a stainless steel screw with 0.5mm in diameter, and recorded epidurally at T9 - T10 spinal cord levels by using a pair of teflon-coated stainless steel wire electrodes with 1mm exposed tip. In order to inject lidocaine and make a lesion, insulated long dental needle with noninsulated tips were placed stareotoxically in VN and mRTN. Lidocaine of $2{\sim}3\;{\mu}l$ was injected into either VN or mRTN. The normal MEPs were composed of typical four reproducible waves; P1, P2, P3, P4. The first wave (P1) was shown at a mean latency of 1.2 ms, corresponding to a conduction velocity of 67.5 m/sec. The latencies of MEPs were shortened and the amplitudes were increased as stimulus intensity was increased. The amplitudes of P1 and P2 were more decreased among 4 waves of MEPs after lidocaine microinjection into mRTN. Especially, the amplitude of P1 was decreased by 50% after lidocaine microinjection into bilateral mRTN. On the other hand, lidocaine microinjection into VN reduced the amplitudes of P3 and P4 than other MEP waves. However, the latencies of MEPs were not changed by lidocaine microinjection into either VN or mRTN. These results suggest that the vestibular and reticular nuclei contribute to partially different role in generation of MEPs elicited by transcranial electrical stimulation.

• 대한약리학회지
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• 제23권2호
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• pp.77-85
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• 1987

혈압과 심박수의 중추조절에 대한 복외측 연수의 choline성 수용체의 역할을 규명하기 위하여 본 연구를 실시하였다. urethane으로 마취한 흰쥐에서 신경흥분성 아미노산인 L-glutamate(300 ng/site)를 복외측 연수에 미세주사하여 승압부위 (VLPA)와 감압부위 (VLDA)를 각각 기능적으로 확인하였다. VLPA와 VLDA에 각각 여러가지 choline성 약물들과 choline성 수용체의 길항제들을 양측으로 미세주사하여 다음과 같은 결과를 관찰하였다. 1. VLPA에 ca.bachol(300 ng/site)를 미세주사한 후 현저한 혈압상승 및 빈맥이 일어났으며, 이 반응은 hexamethonium ($4\;{\mu}g/site$)의 전처치에 의하여 차단되지 않았다. 2. VLPA에 physostigmine (200 ng/site)과 oxot.emo.me (300 ng/site)을 미세주사한 후 각각 현저한 혈압상승이 일어났다. 3. VLPA에 atropine($4\;{\mu}g/site$)을 미세주사한 후 현저한 혈압하강 및 서맥이 일어났다. 4. VLDA에 acetylcholine(500 ng/site)과 dimethylphenylpipe.azinium (500 ng/site)을 미세주사한 후 각각 현저한 혈압하강 및 서맥이 일어났다. 5. VLDA에 acetylcholine(500 ng/site)을 미세주사한 후 유발된 혈압하강 및 서맥반응은 hexamethonium($4\;{\mu}g/site$) 전처치에 의하여 차단되었다. 이상의 결과로 보아 흰쥐의 복외측 연수의 승압부위에서는 muscarine성 수용체를 통하여 혈압상승 및 빈맥반응이 일어나고 감압부위에서는 nicotine성 수용체를 통하여 혈압하강 및 서맥 반응이 일어나는 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권4호
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• pp.399-407
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• 2001

MII단계 난자의 위란강에 retroviral vector를 주입하여, 형질전환 난자의 생산하려는 연구가 수행되고 있다. 그러나 이러한 난자의 위란강의 크기는 매우 다양하므로, 외래유전자를 위란강에 미세주입을 할 때, 난자의 세포질에 손상을 줄 수가 있다. 이에 본 연구에서는 외래유전자 주입시 발생할 수 있는 난자세포의 손상을 최소화하기 위하여 sucrose처리법을 채택하였다. 즉 난자를 0.5%의 sucrose가 첨가된 배양액으로 처리함으로써 일정한 형태의 세포질을 유지하지 못하는 난자와 일정한 형태의 세포질을 유지하는 난자로 분류할 수 있었으며, 후자의 경우 세포질의 큰 손상 없이 retroviral vector를 난자의 위란강내에 주입할 수 있었다. 그러나 sucrose처리에 의해 선별된 난자의 수정율과 대조군의 그것 사이에는 유의차가 없었다. 또 sucrose처리에 의해 선발된 난자에 있어서 retroviral vector (LN$\beta$-EGFP and LNC-hGH) 주입 후의 분할율과 배반포발달율 같은 양상을 보였다. LN$\beta$-EGFP이 주입된 경우, 분할율과 배반포율이 81 및 25% 보였으며, LNC-hGH이 주입된 경우, 83 및 30%를 보였다. 그 결과 미세주입된 난자는 대조군과 유의적인 차이 없이 발달할 수 있었다. 게다가, hGH-gene의 결합율이 PCR 분석에 의하여 분할된 난자에서 52%를 보였으며, 또한 EGFP-gene의 발현율이 현광현미경을 총해 배반포난자 에서 34%가 관찰되었다. 이상의 결과를 종합할 매, 0.5%의 sucrose처리는 우량난자의 선발을 가능하게 하였으며, 주입유전자의 발현율이 낮아지지 않았을 뿐만 아니라, 외래유전자의 위란강내 주입시 난자에 대한 물리적 손상을 줄일 수 있으므로 발달율을 개선할 수 있는 것으로 사료된다.

• 한국동물학회지
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• 제38권3호
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• pp.340-347
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• 1995

D. melanogaster를 대상으로 두 종류의 P element construct, 즉 Pc[(ry+)B]와 p[(ry+)$\Delta$SX9]을 사용한 형질전환 실험을 통하여 자율적 및 비자율적인 P element construct간의 vector로써의 효율성을 분석했다. 자율적인 P element 내에 rosy 유전자를 포함하고 있는 Pc[(ry+)B] construct를 진정 M 계통형인 ry506 돌연변이 계통에 주입시켰다. 또한 비자율적인 P element 내에 rosy 유전자를 포함하고 있는 p[(ry+)$\Delta$SX9] construct와 전이효소의 공급원으로써 p-$\Delta$2-3hs$\pi$ helper plasmid를 역시 같은 계통의 ry506 돌연변이 계통에 주입시켰다. Dechorination 방법에 의해 총 1143 embryo를 대상으로 microinjection 한 결과, 모두 35 계통의 형질전환된 정상형의 눈을 가진 계통을 얻었다. P element construct를 주입시킨 전체 1143 embryo 중에서 약 20% 정도가 성체로 부화되었으며, 부화된 개체 가운데 약 40% 정도가 눈 색깔이 거의 정상형과 같은 G0 transformant 로 나타났다. 그러나 생식력을 가진 G0 transformant의 약 40% 만이 G1 transformant로 나타남으로써 모두 35 계통의 transformant를 얻었다. 따라서 G0 단계에서 나타난 형질전환 현상에는 반드시 rosy transformant의 염색체 삽입에 의해서 만이 아니라 세포질내에서도 construct내의 rosy 유전자의 발현이 가능한 것으로 분석되었다. 또한 형질전환율에 있어서는 Pc[(ry+)B]와p[(ry+)$\Delta$SX9] construct 간에 유의한 차가 없는 것으로 나타났다. 이상의 결과로 볼 때, 실험 목적에 따라 자율적인 P element 또는 helper DNA를 이용한 비자율적인 P element를 효과적인 vector 로 선택 이용함으로써 특정 유전자를 곤충집단내로 침투 및 고정시킬 수 있다고 판단된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권2호
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• pp.95-104
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• 2002

본 연구는 사람의 조혈촉진 유전자(hEPO)가 도입된 형질전환 돼지를 생산하기 위해 사계절동안 수행하였다. 약 8∼15개월령의 순종의 랜드레이스 경산돈 및 미경산돈 42두는 유전자 미세주입을 위한 1세포기 단계의 수정란 채란 및 이식을 위해 사용하였으며, 발정동기화 및 과배란 방법은 PG 600 주입 후 9일간 매일 20mg의 altrenogest를 사료에 첨가하여 급여하였다. Altrenogest를 9일간 급여 후 1,500IU의 PMSG와 500IU의 hCG를 주입하므로서 과배란을 유도하였다. 미세주입을 위한 유전자는 mouse whey acidic protein(mWAP) 프로모터에 hEPO 유전자를 연결하여 준비하였으며, 호르몬 처리후 23두의 공란돈으로 부터 650개의 난자를 회수하였으며, 이 중 83.1%(540/650)는 DNA 미세주입을 위해 전핵을 관찰할 수 있는 1-세포기의 수정란이었다. 이중 유전자가 미세주입 된 543개의 난자를 19두의 수란돈에 이식하였으며 7두의 임신돈으로부터 47두의 자돈을 생산하였다. 생산된 자돈 47두로부터 꼬리조직으로부터 분리된 DNA의 PCR 검정 결과 수컷 1두가 형질전환 양성반응을 나타내어 2.13%의 형질전환율을 나타내었으며, 이러한 연구의 결과는 생체반응기(bioreactor)연구에 있어서 형질전환 돼지생산의 성공적이며 유용한 정보를 제공할 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제26권2호
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• pp.87-94
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• 2002

본 연구는 섬유소분해효소 유전자(CelD)가 도입된 형질전환 돼지를 생산하기 위해 사계절동안 수행하였다. 약 8∼15개월령의 순종의 랜드레이스경산돈 및 미경산돈 126두는 유전자 미세주입을 위한 1세포기 단계의 수정란 채란 및 이식을 위해 사용하였으며, 발정동기화 및 과배란 방법은 PG600 주입 후 9일간 매일 20mg의 altrenogest를 사료에 첨가하여 급여하였다. Altrenogest를 9일간 급여 후 1000IU의 PMSG와 750IU의 hCG를 주입하므로서 과배란을 유도하였다. 미세주입을 위한 유전자는 Rat elasterase promoter에 CelD유전자를 연결하여 준비하였으며, 호르몬 처리후 91두의 공란돈으로부터 1,422개의 난자를 회수하였으며 이중 95.6% (1,359/1,422)는 DNA미세주입을 위해 전핵을 관찰 할 수 있는 1세포기의 수정란이었다. 이중 유전자가 미세주입된 725개의 난자를 35두의 수란돈에 이식하였으며 13두의 임신돈으로부터 65두의 자돈을 생산하였다. 한편 수란돈당 수정란 이식수가 임신율에 미치는 영향을 조사한 결과 약 21∼24개의 수정란을 이식한 구에서 임신율이 50%로 타구의 20.0%(20개 이하)와 33.3%(25개 이상)보다 높았으며, 꼬리조직으로부터 분리된 DNA의 PCR검정결과 65두중 5두가 형질전환 양성 반응을 나타내어 7.69%의 형질전환율을 나타내었다 따라서 본 연구는 생체반응기를 통한 형질전환 돼지생산을 위한 유용한 정보를 제공하게 될 것이다.

• Animal Bioscience
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• 제36권8호
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• pp.1180-1189
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• 2023

Objective: Discovering the mechanism of cell specification is important to manipulate cellular lineages. To obtain lineage-specific cell lines, the target lineage needs to be promoted, and counterpart lineages should be suppressed. Embryos in the early blastocyst stage possess two different cell populations, the inner cell mass (ICM) and trophectoderm. Then, cells in the ICM segregate into epiblasts (Epi) and primitive endoderm (PrE). PrE cells in embryos show specific expression of platelet-derived growth factor (PDGF) and its receptor, PDGF receptor A (PDGFRA). In this study, we suppressed PDGF signaling using two methods (CRISPR/Cas9 injection and inhibitor treatment) to provide insight into the segregation of embryonic lineages. Methods: CRISPR/Cas9 RNAs were injected into parthenogenetically activated and in vitro fertilized embryos. The PDGF receptor inhibitor AG1296 was treated at 0, 5, 10, and 20 µM concentration. The developmental competence of the embryos and the number of cells expressing marker proteins (SOX2 for ICM and SOX17 for PrE) were measured after the treatments. The expression levels of the marker genes with the inhibitor were examined during embryo development. Results: Microinjection targeting the PDGF receptor (PDGFR) A reduced the number of SOX17-positive cell populations in a subset of day 7 blastocysts (n = 9/12). However, microinjection accompanied diminution of Epi cells in the blastocyst. The PDGF receptor inhibitor AG1296 (5 µM) suppressed SOX17-positive cells without reducing SOX2-positive cells in both parthenogenetic activated and in vitro fertilized embryos. Within the transcriptional target of PDGF signaling, the inhibitor significantly upregulated the Txnip gene in embryos. Conclusion: We identified that PDGF signaling is important to sustain the PrE population in porcine blastocysts. Additionally, treatment with inhibitors was a better method to suppress PrE cells than CRISPR/Cas9 microinjection of anti-PDGF receptor α gene, because microinjection suppressed number of Epi cells. The PDGF receptor might control the number of PrE cells by repressing the proapoptotic gene Txnip. Our results can help to isolate Epi-specific cell lines from blastocysts.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권4호
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• pp.305-315
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• 2001

본 연구의 목적은 외래 EGFP 유전자를 분화이전의 웅성생식세포에 도입한 후 이를 난모세포내에 미세주입하여 형질전환동물을 생산하는 기술을 개발하는 데에 있다. 이를 위하여 반수체 정자세포에서 특이적으로 발현하는 생쥐의 mTP1과 햄스터의 hPrm2 유전자 발현 시기를 RT-PCR로 조사한 결과 그시기는 생쥐와 햄스터에서 각각 18일령과 20일령으로 확인되었다. 이에 따라 외래 유전자의 침입이 용이한 감수분열 직전단계인 17일령의 생쥐와 19일령의 햄스터 정자세포를 EGFP 유전자가 포함된 배양액에 부유시킨 다음, 전기자극을 부여한 결과 0.18 ㎸/cm의 전기자극을 가한 후 72시간 배양한 정자세포의 28.5%와 32.1%에서 EGFP 유전자가 발현되는 것으로 확인되었다. EGFP유전자가 도입된 반수체 정자의 수정 및 발달 능력을 검증하기 위하여, 이들 정자세포를 햄스터 난자 내에 미세주입 하였으나, 형광현미경하에서는 EGFP유전자의 발현은 관찰할 수 없었다. 이에 이들 난자를 공시하여 PCR분석을 실시한 결과, 약 44%의 수정란에서 EGFP 유전자의 존재가 확인되었다. 이러한 결과로 보아 반수체 정자세포는 외래 유전자를 난자 내에 도입하기 위한 운반체로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

• 한국정밀공학회:학술대회논문집
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• 한국정밀공학회 2010년도 춘계학술대회 논문집
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• pp.963-964
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• 2010