• Molecules and Cells
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• 제42권2호
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• pp.123-134
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• 2019

Lysophosphatidic acid (LPA) is an endogenous lysophospholipid with signaling properties outside of the cell and it signals through specific G protein-coupled receptors, known as $LPA_{1-6}$. For one of its receptors, $LPA_1$ (gene name Lpar1), details on the cis-acting elements for transcriptional control have not been defined. Using 5'RACE analysis, we report the identification of an alternative transcription start site of mouse Lpar1 and characterize approximately 3,500 bp of non-coding flanking sequence 5' of mouse Lpar1 gene for promoter activity. Transient transfection of cells derived from mouse neocortical neuroblasts with constructs from the 5' regions of mouse Lpar1 gene revealed the region between -248 to +225 serving as the basal promoter for Lpar1. This region also lacks a TATA box. For the region between -761 to -248, a negative regulatory element affected the basal expression of Lpar1. This region has three E-box sequences and mutagenesis of these E-boxes, followed by transient expression, demonstrated that two of the E-boxes act as negative modulators of Lpar1. One of these E-box sequences bound the HeLa E-box binding protein (HEB), and modulation of HEB levels in the transfected cells regulated the transcription of the reporter gene. Based on our data, we propose that HEB may be required for a proper regulation of Lpar1 expression in the embryonic neocortical neuroblast cells and to affect its function in both normal brain development and disease settings.

• The Korean Journal of Physiology and Pharmacology
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• 제26권5호
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• pp.347-355
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• 2022

Abdominal aortic aneurysm (AAA) is a life-threatening disorder worldwide. Fibroblast growth factor 21 (FGF21) was shown to display a high level in the plasma of patients with AAA; however, its detailed functions underlying AAA pathogenesis are unclear. An in vitro AAA model was established in human aortic vascular smooth muscle cells (HASMCs) by angiotensin II (Ang-II) stimulation. Cell counting kit-8, wound healing, and Transwell assays were utilized for measuring cell proliferation and migration. RT-qPCR was used for detecting mRNA expression of FGF21 and activating transcription factor 4 (ATF4). Western blotting was utilized for assessing protein levels of FGF21, ATF4, and markers for the contractile phenotype of HASMCs. ChIP and luciferase reporter assays were implemented for identifying the binding relation between AFT4 and FGF21 promoters. FGF21 and ATF4 were both upregulated in Ang-II-treated HASMCs. Knocking down FGF21 attenuated Ang-II-induced proliferation, migration, and phenotype switch of HASMCs. ATF4 activated FGF21 transcription by binding to its promoter. FGF21 overexpression reversed AFT4 silencing-mediated inhibition of cell proliferation, migration, and phenotype switch. ATF4 transcriptionally upregulates FGF21 to promote the proliferation, migration, and phenotype switch of Ang-II-treated HASMCs.

• Radiation Oncology Journal
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• 제17권4호
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• pp.299-306
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• 1999

목 적 : Ataxia-Telangiectasia (AT) 증은 여러 가지 유전적 결함을 갖는 질병으로 방사선 민감도가 비정상적으로 상승되어 있는 것이 특징이다 AT 환자에서 공통적으로 존재하는 ATM 유전자는 현재까지 방사선 신호전달에 관여하는 것으로 알려진 Pl-3 kinase와 유사한 구조임이 알려져 ATM이 방사선 신호전달경로에 중요한 작용을 할 것으로 추정하게 되었다. 본 연구에서는 AT 세포와 정상세포에 PKCI를 과발현 시킴으로써 방사선 신호전달에 관여하는 PKC를 억제하여 이것이 방사선 민감도에 미치는 영향을 관찰하고, 방사선에 의해 유도되는 early response gene인 c-fos transcription의 차이를 측정하여 ATM과 PKCI에 의한 신호전달이 c-fos 유전자 전사에 미치는 영향을 분석하고자 하였다. 대상 및 방법 : PKCI expression vector를 작제한 후 정상세포인 LM217과 AT세포인 AT5BIVA에 transfection 시킨 후 plasmid의 genomic DNA에 결합된 것은 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 확인하였고 PKCI의 mRNA 발현 여부는 northern blotting으로 확인하였다. 방사선 민감도는 아포토시스로 측정하였으며 PKCI가 과발현된 각 세포주에 5 Gy의 방사선을 조사한 후 48시간에 세포를 모아 TUNEL방법으로 아포토시스 세포의 수를 측정하였다. c-fos 유전자의 전사는 reporter 유전자로 c-fos CAT plsmid를 $\beta$-gal expression vector와 같이 각 세포주에 transfection 시키고 36시간이 지난 후 CAT assay를 하여 activity를 측정하고 동시에 $\beta$-gal assay를 시행하여 transfection 효율을 보정해 주었다. PKCI, Ras의 영향을 보기 위하여는 PKCI, Ras expression vector와 c-fos CAT plasmid를 cotransfection하고 CAT activity로 측정 하였다. 결 과 : 이 실험의 결과 LM과 AT 세포에서 PKCI가 방사선 민감도에 미치는 영향과 c-fos 전사에 미치는 영향을 처음으로 보여주었다. PKCI의 과발현이 LM 세포에서는 방사선 민감도를 증가시켰지만 AT세포에서는 오히려 약간 감소시키는 작용을 나타내었다. c-fos 전사는 AT 세포에서 LM 세포에 비하여 70배 낮게 나타났는데 PKCI가 과발현 됨으로써 LM 에서는 c-fos의 전사가 감소되었지만 AT 세포에서는 영향이 없었다. Ras 단백으로 c-fos를 유도시키고 여기에 PKCI 발현 백터를 contransfection 하면 LM세포에서는 induction 이 감소되었지만 AT 세포에서는 영향이 없었다. 즉 LM과 AT 세포에서의 PKCI에 의한 반응의 차이는 Ras와 관련된 signal transduction pathway라는 것을 알 수 있었다. 결 론 : PKCI는 정상세포에서는 방사선에 의한 세포 손상을 증가시키지만 AT 세포에서는 별 영향을 보이지 않는 것을 알 수 있었으며, 두 세포간의 이러한 차이는 c-fos proto-oncogene의 전사차이로 설명할 수 있겠다. 이러한 차이가 AT 세포의 방사선 민감도의 한 원인일 것으로 생각된다.

• 생명과학회지
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• 제31권11호
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• pp.1028-1036
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• 2021

반딧불이 루시퍼레이즈(FLuc)는 유전자나 바이러스 치료제에 있어서 효과적인 표적으로 이용될 수 있다. 하지만, 외래 물질이라는 것과 acyl-CoA와의 유사성으로 인하여 FLuc의 임상적 적용은 아직까지 이뤄지지 않았다. 본 연구에서, 우리는 FLuc의 안전성을 보여주기 위한 목적으로 일련의 전임상 실험과 인체실험을 수행했다. 우선, FLuc의 세포막 투과성을 점검하기 위해 FLuc 유전자를 담지한 OTS-412와 FLuc 재조합 단백질을 이용했다. OTS-412를 다양한 세포에 감염시켰을 때, FLuc의 활성은 세포 용해물에서만 관찰됐고, 세포를 배양한 배지에서는 관찰되지 않았다. 재조합 단백질 역시 세포막을 투과하지 못했다. 동물실험에서도 이와 유사한 결과가 관찰됐다. VX-2 종양세포에 처리된 토끼에 OTS-412를 처리했을 때, FLuc의 활성은 오직 종양조직에서만 발견됐고, 다른 장기나 혈액에서는 관찰되지 않았다. FLuc의 인체 반응성을 조사하기 위해 각기 다른 장기에서 유래된 세포 용해물을 FLuc에 반응시켰으나 아무런 활성이 관찰되지 않았다. 마지막으로, FLuc 재조합 단백질을 인체에 정맥주사 방식으로 투여했다. FLuc는 혈액에서 20에서 30분의 반감기를 가지고 분해됐으며, 주사한지 1시간 30분 후에는 검출되지 않았다. 또한, 혈장 샘플이 지방산과 반응을 보이지 않았다. FLuc의 접종 전과 후의 결과를 비교했을 때에도 임상적으로 유의미한 변화가 없었다. 따라서, 본 연구는 FLuc의 안전성에 대한 우려를 종합적으로 불식시킨다.

• Nuclear Medicine and Molecular Imaging
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• 제41권5호
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• pp.343-349
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• 2007

방사성옥소는 갑상선암의 핵의학적 영상과 방사성치료에 널리 그리고 성공적으로 사용되어 왔다. 최근 세포의 옥소섭취를 담당하는 운반체로서 Na/I symporter (NIS)의 분자세포학적 특성이 규명되고 그 유전자가 클로닝되면서 앞으로는 갑상선암 이외의 각종 암에도 NIS 유전자를 외부에서 전달함으로써 방사성옥소 치료를 적용하는 새로운 암치료 기술이 가능할 것으로 기대되고 있다. 방사성옥소를 이용한 암치료의 성공을 위해서는 NIS를 통한 표적세포의 옥소 섭취를 극대화 시키는 것이 핵심이다. TSH는 갑상선 세포의 NIS 발현을 항진시키고 retinoic acid는 갑상선암과 유방암 세포의 NIS발현을 증가시키는 효과가 있다. 또 일반 암세포에는 NIS 유전자를 전달하여 발현 시킬 수 있다. 그러나 NIS 발현 만으로는 원하는 수준의 방사성옥소 섭취를 충분히 얻지 못할 수 있다. 이는 세포의 옥소 섭취가 NIS 단백질의 총량이 아니라 세포막에 위치한 NIS의 양에 의해 결정되기 때문이다. 즉, 옥소를 섭취하려는 전사된 NIS단백질이 세포막으로 이동하여 정상적으로 기능하게 하는 조절 기전이 중요하다. NIS의 세포막 이동 기전은 아직 밝혀져 있지 않으나 다른 운반체와 유사하게 단백질의 전사후 glycosylation이나 phosphorylation이 관여할 것으로 생각된다. 본 연구진은 NIS 유전자를 전달한 암세포에서epidermal growth factor를 통한 extracellular signal regulated kinase 신호경로의 활성화가 방사성옥소 섭취를 항진시킴을 관찰하여 NIS의 전사외 기능조절 기전을 조사하고 있다. 앞으로 NIS기능에 대한 조절기전이 보다 자세하게 밝혀지면 방사성옥소 치료기술과 NIS유전자 영상기술의 개선과 발전에 도움이 될 것으로 기대된다.

• Molecules and Cells
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• 제45권3호
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• pp.122-133
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• 2022

The aim of this study was to investigating whether lncRNA H19 promotes myocardial fibrosis by suppressing the miR-29a-3p/miR-29b-3p-VEGFA/TGF-β axis. Patients with atrial fibrillation (AF) and healthy volunteers were included in the study, and their biochemical parameters were collected. In addition, pcDNA3.1-H19, si-H19, and miR-29a/b-3p mimic/inhibitor were transfected into cardiac fibroblasts (CFs), and proliferation of CFs was detected by MTT assay. Expression of H19 and miR-29a/b-3p were detected using real-time quantitative polymerase chain reaction, and expression of α-smooth muscle actin (α-SMA), collagen I, collagen II, matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), and elastin were measured by western blot analysis. The dual luciferase reporter gene assay was carried out to detect the sponging relationship between H19 and miR-29a/b-3p in CFs. Compared with healthy volunteers, the level of plasma H19 was significantly elevated in patients with AF, while miR-29a-3p and miR-29b-3p were markedly depressed (P < 0.05). Serum expression of lncRNA H19 was negatively correlated with the expression of miR-29a-3p and miR-29b-3p among patients with AF (r_s = -0.337, r_s = -0.236). Moreover, up-regulation of H19 expression and down-regulation of miR-29a/b-3p expression facilitated proliferation and synthesis of extracellular matrix (ECM)-related proteins. SB431542 and si-VEGFA are able to reverse the promotion of miR-29a/b-3p on proliferation of CFs and ECM-related protein synthesis. The findings of the present study suggest that H19 promoted CF proliferation and collagen synthesis by suppressing the miR-29a-3p/miR-29b-3p-VEGFA/TGF-β axis, and provide support for a potential new direction for the treatment of AF.

• Nuclear Medicine and Molecular Imaging
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• 제42권3호
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• pp.235-245
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• 2008

목적: 간암은 치명적인 질환으로 유전자 치료가 기존 치료의 대체적 치료로 기대되고 있으며, 이러한 치료법의 발달과 함께 유전자의 발현을 평가할 수 있는 보고 유전자 시스템의 필요하다. 그 중 HSV1-tk 유전자는 보고 유전자로서 필요한 조건을 두루 만족시키고 있을 뿐만 아니라 별도의 치료유전자를 따로 이입할 필요가 없다는 장점을 가지고 있어 가장 많이 사용되는 방법이다. 이 연구는 간암의 유전자 치료를 위해 간암 동물 모델에서 유전자로 HSV1-tk를 사용하고 보고 기질로 방사성 요오드 표지 2'-fluoro-2'-deoxy-1-${\beta}$-D-arabinofuranosyl-5-iodouracil (FIAU)를 사용하여 소동물 양전자 방출영상(positron emission tomography, PET)을 얻어 비침습적 생체 유전자 발현 영상의 가능성을 확인하고 자 하였다. 대상 및 방법: HSV1-tk 보고 유전자 이입 간암세포주인 MCA-tk와 MCA 세포주를 이용하여 in vitro 상에서의 [$^{125}I$]FIAU의 섭취실험과 섭취량과 발현량의 상관성평가를 위해 세포수 백분율에 따른 섭취실험을 실시하였다. 피하 간암 동물모델을 이용하여 [$^{125}I$]FIAU의 생체분포를 평가하였으며 [$^{125}I$]FIAU를 이용하여 소동물 PET을 통한 생체영상을 분석하였다. 결과: HSV1-tk 유전자가 이입된 MCA-tk 세포에서는 특이적인 동위원소의 집적이 발생하였으며 대조군인 MCA에서는 거의 집적이 이루어지지 않았다. 섭취 후 480 분에서 두 세포주의 섭취비는 15 배로 나타났다. MCA-tk 세포주의 백분율이 증가함에 따라 [$^{125}I$]FIAU의 섭취량도 직선적 상관관계($R^2=0.9644$)에 따라 증가하여 기질의 섭취량이 유전자 발현량을 잘 반영하고 있음이 확인되었다. 피하 종양 동물모델의 생체분포 결과 [$^{125}I$]FIAU는 초기에 신장으로 빠르게 배출되며 1 시간 이후 생체내 deiodinase에 의하여 분해되어 위와 갑상선의 섭취가 증가된 값을 보였다. MCA-tk 종양 대 혈액 비와 MCA-tk 종양 대 근육 비는 투여 후 24 시간 사이에 최대 641의 값을 나타내었다. 또한 HSV1-tk 유전자가 발현하지 않은 MCA종양에 비하여 MCA-tk 종양은 192.7 배 높은 섭취를 보여 [$^{125}I$]FIAU의 섭취는 HSV1-tk 유전자 발현에 특이적임을 확인하였다. MCA-tk 종양 대 간의 집적의 경우에도 초기 1시간에 13.8 배, 4 시간에 66.8 배, 24 시간에 혈액 비와 비슷한 정도의 588.3배 이상의 대조도를 보여 주었다. [$^{124}I$]FIAU를 보고 기질로 사용한 소동물 PET 생체영상에서 대조군인 MCA 종양과 보고 유전자가 이입된 MCA-tk 종양에의 집적이 차이가 매우 큰 대조도를 보여주었으며 생체분포 결과와 일치하는 양상을 나타내었다. 결론: $^{125}I$-FIAU가 세포 섭취율 시험과 생체 분포에서 MCA-tk 종양에 높은 집적을 나타내었고 $^{124}I$-FIAU를 이용한 소동물 PET 영상에서 MCA-tk 종양이 표적장기인 간이나 MCA 종양에 비하여 매우 높은 대조도를 나타냈다. 향후, 간암의 유전자 치료에서 FIAU은 HSV1-tk를 보고 유전자로 사용할 때 적절한 기질로서 비침습적으로 핵의학 영상을 이용한 유전자 발현의 평가를 가능하게 할 수 있을 것으로 기대된다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제36권4호
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• pp.283-292
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• 2009

목 적: 인간 배아줄기세포 (human embryonic stem cells; hESCs)는 체외에서 오랫동안 증식할 수 있으며, 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포이다. 그러므로, 인간 배아줄기세포는 세포치료의 세포공급원의 역할을 할 수 있을 것으로 기대를 모으고 있다. 인간 배아줄기세포로의 외래 유전자의 도입은 분화경로 규명 및 특정 유전자의 기능 규명 등에 효과적으로 이용될 수 있다. 본 연구에서는 렌티 바이러스를 이용하여 eGFP 유전자를 XY와 XX 핵형을 가진 인간 배아줄기세포주에 도입하고자 하였다. 연구방법: 렌티 바이러스를 이용하여 eGFP 유전자를 인간 배아줄기세포에 도입하였다. 도입된 eGFP의 발현은 형광현미경을 이용하여 확인하였으며, 유세포 분석을 통하여 eGFP 발현세포의 비율을 분석하였다. 또한, eGFP가 도입된 인간 배아줄기세포에서 표지인자인 Oct4, SSEA4 및 Tra-1-81의 발현을 확인하였으며, 배아체의 형성 여부를 확인하여 특성분석을 수행하였다. 결 과: eGFP는 인간 배아줄기세포로 성공적으로 도입되었다. eGFP의 발현은 40 계대 이상 안정적으로 지속되었다. eGFP를 발현하는 인간 배아줄기세포는 eGFP 도입 후에도, 배아줄기세포의 특성을 유지하고 있음이 확인되었다. 또한, 자연적 분화 동안 발현이 감소하는 현상이 관찰되었다. 결 론: 본 연구에서는 렌티 바이러스를 이용하여 eGFP가 도입된 인간 배아줄기세포주를 확립하였으며, 그 특성이 유지되고 있음을 확인하였다. 표지 유전자가 도입된 인간 배아줄기세포주는 분화 및 다른 연구에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

• 한국응급구조학회지
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• 제12권3호
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• pp.87-98
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• 2008

Purpose : This study was designed to figure out the necessity of continuing basic CPR education for the higher grade students of elementary school. The assessment contents were knowledge, practice ability, precision level of CPR skills and continuation of the educational efficiency. Methods : Twenty two students of 4th and 5th grade of elementary school in K city in Chungcheongnam-do were recruited for this study. The study method was a control group of non-synchronized design. A preliminary study was done on October 27 in 2006. The main study was performed from February 14 to May 11 in 2007. The researcher adopted the method of Kyung-hui, Kang (1998) such as awareness, attitude and knowledge in control group, emergency medical technician test protocol, Anne/SkillReporter$^{(R)}$ in case of the basic CPR knowledge. Four times of measures were done in shortly after practicing CPR, 4 weeks after the education, 8 weeks after the education, and 12 weeks after the education. By using SPSS/PC+ (version 12.0), the researcher analyzed the collected data based on frequency, percentage, repeated measurement, ANOVA (analysis of variance), and sidak (multiple comparison - sidak). Results : 1) The confidence of people in the control group in terms of practicing CPR showed a statistically meaningful difference (t = 10.230, p = .000) before/after CPR education. Therefore, hypothesis No.1-1 was accepted. 2) The educational necessity of people in the control group showed no statistically meaningful difference (t = -1.695, p = 0.105) before/after CPR education. Therefore, hypothesis No.1-2 was rejected. 3) The knowledge points of people in the control group showed a statistically meaningful difference (t = -7.731, p = .000) before/after CPR education. Therefore, hypothesis No.2 was accepted. 4) The confidence of people in the control group in terms of practicing CRP showed no meaningful difference (F = 2.789, p = 0.072) as time passed. Therefore, hypothesis No.3 was rejected. 5) The knowledge of people in the control group showed a meaningful difference (F = 9.090, p = .000) as time passed. Therefore, hypothesis No.4 was accepted. 6) The capability of people in the control group in terms of practicing CPR showed a statistically meaningful difference (F = 42.795, p = .000) as time passed. Therefore, hypothesis No.5 was accepted. 7) The precision level of CPR skill of people in the control group showed a statistically meaningful difference (F = 25.198, p = .000) as time passed. Therefore, hypothesis No.6-1 was accepted. 8) The precision level of chest compression skill of people in the control group showed a statistically meaningful difference (F = 5.188, p = .003). Therefore, hypothesis No.6-2 was accepted. Conclusion : In a nutshell, CPR education for the 4th and 5th graders of elementary schools had an influence on their confidence in practicing CPR and on their knowledge. This study showed that as time passed. the educational effect declined in terms of knowledge point, capability of practicing CPR, and the precision level of CRP skill. The results of the study could be postulated into the fact that re-education within 8 weeks after the first education was essential to retaining the educational effect. Therefore, we need to vitalize the CPR education for elementary school students repeatedly on a regular basis in order to continue the educational effect after they were grown-ups and to make them play their roles as a first aider.

• BMB Reports
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• 제40권5호
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• pp.749-756
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• 2007

Phosphorylation on serine/threonine or tyrosine residues of target proteins is an essential and significant regulatory mechanism in signal transduction during many cellular and life processes, including spermatogenesis, oogenesis and fertilization. In the present work, we reported the isolation and characterization of mouse testis-specific serine/threonine kinase 5 (Tssk5), which contains four alternatively spliced variants including, Tssk5$\alpha$, Tssk5$\beta$, Tssk5$\gamma$ and Tssk5$\delta$. Moreover, the locus of Tssk5 is on chromosome 14qC3 and the four variants had a similar high expression in the testis and the heart; however, had a low expression in other tissues, except for Tssk5$\alpha$ which also had comparably high expression in the spleen. Each variant of Tssk5 expression began in the testis 16 days after birth. Aside from TSSK5$\alpha$, the other isoforms have an insertion of ten amino acid residues (RLTPSLSAAG) in region VIb (HRD domain) (His-Arg-Asp). Moreover, only TSSK5$\alpha$ exhibited kinase activity and consistently, a further Luciferase Reporter Assay demonstrated that TSSK5$\beta$, TSSK5$\gamma$ and TSSK5$\delta$ cannot be stimulated at the CREB/CRE responsive pathway in comparison to TSSK5$\alpha$. These findings suggest that TSSK5$\beta$, TSSK5$\gamma$, TSSK5$\delta$ may be pseudokinases due to the insertion, which may damage the structure responsible for active kinase activity. Pull-down assay experiments indicated that TSSK5$\beta$, TSSK5 $\gamma$ and TSSK5$\delta$ can directly interact with TSSK5$\alpha$. In summary, these four isoforms with similar expression patterns may be involved in spermatogenesis through a coordinative way in testis.