• 대한수의학회지
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• 제34권4호
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• pp.735-744
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• 1994

미성숙 래트의 외경정맥에 카테타를 장착하고, 다음날(28일령) 대조군에는 4IU, 다배란처치군에는 20IU의 PMSG를 피하 주사하였다. 각 실험동물은 혈중의 LH농도 변화를 측정하기 위하여 PMSG 투여직전(0시간), 투여후 12시간, 그 이후 6시간 간격으로 혈액을 채취하고 72시간에 희생시켰다. 그 결과 다배란용량의 PMSG 투여는 먼저 배란반응을 대조군에 비하여 4.0배나 현저하게(P<0.05) 증가시켰다. 또한 난관으로부터 회수된 다배란난자는 상당히 다른 감수분열상의 핵성숙도를 나타내었는데, 즉 prophase I이 14.7%, anaphase I이 36.2%, telophase I이 10.3%, metaphase I/II가 32.4%이었다. 그러나 대조군의 래트에서는 대다수(94.0%)의 난자가 한결같이 metaphase II상을 보였다. 그리고 혈청 LH농도는 radioimmunoassay(RIA)에 의하여 결정되었는데, 먼저 두군 모두 두개의 분명한 peak을 가진 경시적 변화관계를 보였다. 즉 이들 두군에 있어서 LH농도변화는 0-18시간대에 처음으로 완만한 증가와 54-60시간대에 두번째의 급격한 증가(surge)를 보였다. 그러나 두군간에 LH농도의 크기는 현저하게 달라, 다배란처치군의 동물에 있어서는 두번째의 LH peak에 앞서 전반적인 LH농도가 대조군보다 현저하게(P<0.001) 높았으나, FMSG 투여후 60시간에 일어나는 peak에 있어서는 LH농도가 대조군보다 현저하게(P<0.001) 54%나 낮았다. 덧붙여 두 peak간의 증가폭은 대조군에 비하여 다배란처치군에서 훨씬 낮았다. 다배란래트에 있어서 54시간 이전에 최초로 연속적인 증가를 보인 고농도의 혈청 LH는 실제적으로 투여된 PMSG와 측정시의 LH항체와의 교차반응(cross-reaction)에 의한 결과로 판명되었고, 한편 54시간과 60시간에 있어서 두번째로 급격한 증가를 보인 혈청 LH는 주로 뇌하수체로부터 분비되는 내재성 LH surge에 의한 것으로 사료된다. 본 연구 결과는 PMSG투여된 래트에 있어서 혈청 LH의 경시적인 변화상 및 그 특징을 정의한다. 그리고 전체적인 연구결과는 첫째, 다배란용량의 PMSG투여에 따른 배란반응의 증가가 주로 PMSG 자체에 함유된 고나도트로핀 작용과 연관이 있고, 둘째, 미성숙 또는 부동기적 핵성숙을 보이는 다배란난자의 회수는 최초의 혈청 LH의 연속적인 증가 및 이의 연이은 감퇴로 특징지워지는 LH활동도의 비정상적 혈중변화에 기인함을 시사한다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제29권3호
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• pp.273-281
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• 2014

This study was carried out to establish the system of OPU derived embryo production, management of recipients as well as offspring production. OPU derived embryo production system was carried out of aspiration of immature oocytes 2 times per week, total 24 times for 3 months by an ultrasonographic guided follicular aspiration system and then produced in vitro-produced blastocysts by in vitro maturation, fertilization and culture system. This work was collected total 13,866 oocytes, average $8.2{\pm}4.5$ oocytes per session and 8,170 G1 + G2 grade oocytes, average 4.8 oocytes per session by 1,692 times session of total 71 donors for 4 years from 2010 to 2013. The rate of cleavage and blastocyst developmental competence were obtained 11,825 (85.3%) and 5,032 (36.3%) that was $7.0{\pm}3.8$ cleaved embryos and $3.0{\pm}2.5$ blastocysts per session. OPU derived embryo transfer were taken place in 2, 4, 6 and 7 local governments at 2010, 2011, 2012 and 2013 for 4 years and pregnancy rate were obtained 41.2, 43.9, 46.5 and 49.7% in each years. It means that pregnancy rate was continuously improved according of every year for 4 years. Pregnancy rate was significantly different according to individual local government in which was 62.7% in B, but 24.2% in F at 2012. Paternity identification was carried out total 26 offspring in C local government of 2012 and then confirmed 100% agreement of its analysis. In conclusion, the results obtained the possibility of mass production of elite cow embryos as well as offspring by OPU derived embryo production system, of which could be decreased the required time of genetic improvement.

• 한국수정란이식학회지
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• 제29권1호
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• pp.35-41
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• 2014

Laparoscopic ovum pick-up (LOPU) is a convenient method for collecting oocytes in small ruminants. LOPU has the advantage of being a less invasive means of oocyte collection, thereby allowing for a repeated usage of the oocyte donor animals. A total of 25 Korean black goats were used in the winter season (December to February) and LOPU was applied to the goats which had been treated for superovulation more than two times during the last twelve months. Estrus was synchronized with an intravaginal insert containing 0.3 g progesterone for 10 to 12 days. Ovaries were hyperstimulated with eCG 1,000 IU oneshot, FSH with eCG (50 mg / 1,000 IU; 70 mg / 500 IU; 70 mg / 1,000 IU) oneshot or FSH multiple-shot with eCG oneshot ($20mg{\times}6/300IU$) given intramuscularly 72 h prior to LOPU. For these groups, the number of follicles (mean ${\pm}$ SEM) observed which developed to larger than 2 mm in diameter were $1.6{\pm}2.5$, $4.3{\pm}3.1$, $5.5{\pm}4.2$, $6.6{\pm}2.1$ and $8.8{\pm}7.8$, respectively. Oocytes were aspirated by using OPU needles and a vacuum pump. The overall oocyte retrieval rates were 41.4%. Oocytes were matured in TCM-199 supplemented with 10% (w/v) bovine serum albumin + $10{\mu}g/ml$ FSH + $1{\mu}g/ml$ $17{\beta}$-estradiol for 27 h at $39^{\circ}C$ in 5% $CO_2$ in air. Oocytes were parthenogenetically activated by ionomycin combined with 6-diethylaminopurine (6-DMAP). Total oocyte maturation and cleavage rate were 67.3% and 78.8%, respectively. In summary, LOPU is a useful oocyte collection method in Korean black goats that can provide immature oocytes for transgenesis or nuclear transfer.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권1호
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• pp.19-28
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• 2001

소 미성숙 난자 (GV stage)의 동결에 중요한 영향을 미치는 평형시간과 동결속도가 융해후 생존율 및 배발달율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 미성숙 난자의 동결 융해후 체외성숙, 체외수정 및 배반포 발달 능력을 알아보았다. 본 실험에 사용한 동결액의 조성은 침투성 보호제(Ethylene glycol, EG)와 비 침투성 보호제(Ficoll ; F, polyvinylpyrrolidone; PVP, Sucrose; S, Trehalose ; T)를 혼합하여 네가지 조성의 동결액을 준비하였다. 즉EFT: 10% EG + 5% F + 0.05M T, EFS: 10% EG + 5% F + 0.05M S, EPT: 10% EG + 5% P + 0.05M T, EPS: 10% EG + 5% P + 0.05M S이다. 네가지 동격액 (EFT, EFS, EPT, EPS)을 이용하여 미성숙 소 난자 (GV stage)의 최적 평형 시간을 알아보기 위하여 각각 10, 15, 20분의 평형후 동결 응해하였다(실험 1). EPT액에서 15분의 평형시간이 가장 좋은 생존율을 나타내었다(83.05%). 동결 속도가 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 각각 17$^{\circ}C$, $0^{\circ}C$ 및 -6$^{\circ}C$로 동결 속도를 달리 설정하여 동결 융해를 실시하였다(실험 2). 융해후 생존율은 대부분 $0^{\circ}C$로 시작하는 동결속도에서 가장 좋은 성적을 나타내었다. 즉 EFT, EPT, EPS에서 각각 78.1, 73.7, 74.7%의 생존율을 나타내었다. 동결융해 하지 않은 신선란과 동결 응해한 미성숙 난자의 핵 성숙율은 각각 87.2%와 62.3%가 metaphase II로 발달하였다. 동결 응해 미성숙 난자의 IVM, IVF후 난분할율은 EFT, EFS, EPT 그리고 EPS에서 각각 32.57, 23.21, 38.39 그리고 21.33%로 EPT에서 가장 높았으나 유의차는 없었다. 배반포 발달율도 각각 2.86, 3.57, 4.46 그리고 0.47%로서 유의적인 차이를 보이지 않았다. 동결융해 미성숙 난자의 IVM, IVF후 TCM199와 CR-1aa배양액을 이용하여 소 난관상피세포(BOEC)와 공배양 한 결과 배양액의 종류에 따라 난분할율과 배반포 발달율에서는 차이를 보이지 않았다. 또한 미성숙 소 난자의 동결 융해후 얻은 배반포 수정란을 자연발정 Holstein 수란우에 7일째 비외과적으로 이식하였다. 6두에 9개의 수정란을 이식하여 2두가 임신이 확인되었으나 1두는 45일경 유산되었고, 나머지 1두는 장기재태로 분만을 유도하였으나 사산되었다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제21권3호
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• pp.255-262
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• 2006

본 연구는 Open Pulled Straw(OPS)방법에 의해 동결-융해한 돼지 수정란의 체외 생존 능력을 검토하기 위하여 수행되었다. 미성숙 난자의 체외 성숙을 위하여, 돼지 난소는 도축장에서 회수하였으며, 난구세포로 쌓여있는 난자는 직경 $2{\sim}6mm$의 난포로부터 난포액과 함께 흡입에 의하여 회수하였다. 회수된 미성숙 난자의 체외 성숙을 위하여 5 mM hypotaurine, 0.57 mM cysteine, 10% 난포액, 10 IU/ml PMSG 및 10 IU/ml hCG가 함유된 NCSU-23 배양액 내에서 $21{\sim}22$ 시간 배양 후, 호르몬 물질을 제거한 성숙 배양액 내에서 $21{\sim}22$ 시간 동안 추가 배양하였다. 한편 체외 수정을 위하여 동결-융해한 정액은 5.56 mM glucose, 0.33 mM na-pyruvate, 100 IU/ml penicillin, $100 {\mu}g/ml$ streptomycin 및 4 mg/ml BSA가 첨가된 D-PBS 액을 가지고 1,500 rpm에서 10분간 2회 원심분리를 실시하여 세척하였다. 체외 수정을 위한 배양액은 pH $7.2{\sim}7.4$에서 2 mM caffeine과 2 mg/ml BSA가 첨가된 mTBM 배양액을 이용하였다. 체외 수정시 정자의 최종 농도는 $2.5{\times}10^6cells/ml$로 조정하였다. 수정 8시간 후, 체외 발육을 위하여 5.0 mM hypo-taurine, 4 mg/ml BSA 및 10 ng/ml EGF가 첨가된 NCSU- 23액으로 옮겨 7일간 배양을 계속하였다. 그 후 배반포의 여러 단계에서 OPS 법에 의해 동결-보존하였다. 그 결과, 동결-융해 후 형태학적으로 정상적인 수정란의 비율은 초기 배반포(28.3%)보다는 확장 배반포(38.9%)단계에서 동결했을 때 유의적으로 높게 나타났다(p<0.05). 한편, 동결-융해 후 상해를 입은 수정란의 비율은 확장 배반포보다는 초기 배반포 단계에서 동결된 수정란에서 유의적으로 높은 성적을 보였다(p<0.05). 또 다른 실험에서, 수정란의 동결-융해 후 형태학적으로 정상인 수정란을 48시간 추가 배양했을 때, Hatching 된 수정란의 비율은 초기 배반포, 배반포 및 확장배반포기 단계에서 동결-융해한 수정란에서 각각 6.7, 20.0 및 33.3%로 발육 단계가 높을수록 동결-융해 후의 생존율도 높게 나타났다. 본 연구의 결과로부터, 돼지에서 수정란의 동결-융해 후 생존성의 향상을 위해서는 발육 단계가 높은 배반포기 단계에서의 동결이 요구되며 본 연구에서 이용된 OPS 동결 방법이 폭넓게 활용될 것으로 사료된다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제36권3호
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• pp.175-186
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• 2009

목 적: Hypoxanthine (Hx)과 FSH가 미성숙난자의 배양에 미치는 영향을 관찰하기 위해 미성숙난자를 배양하여 GVBD, MII기 발생률을 비교 관찰하였다. 연구방법: 단순배양액인 BSAL-XI-HTF 배양액을 사용하여 (1) 0.3% BSA mBASAL-XI-HTF (0.3% BSA 배양액), (2) 0.1 IU/ml FSH를 첨가한 0.3% BSA mBASAL-XI-HTF (FSH 0.3% BSA 배양액), (3) 10% FBS mBASAL-XI-HTF (10% FBS 배양액), (4) 0.1 IU/ml FSH를 첨가한 10% FBS mBASAL-XI-HTF (FSH 10% FBS 배양액)의 4종류의 배양액을 만들었고, 각 종류의 배양액에서 생쥐 난구세포로 둘러싸인 미성숙난자의 성숙을 3, 6, 18시간별로 비교 관찰하였다. 각 배양액에 1 mM, 2 mM, 4 mM 농도의 미성숙난자성숙억제제인 Hx을 섞어 난자의 성숙억제양상을 관찰하였고 GVBD와 MII기 발생률을 비교 관찰하였다. 결 과: Hx을 첨가하지 않은 4종류의 배양액에서 미성숙난자의 자연성숙은 3시간 내에 대부분 GVBD가 발생하였고 MII기로의 발육은 6시간 이후 발생하였다. 18시간 후 각 군의 배양에서 모두 유사한 GVBD 발생률을 보였다. 1 mM, 2 mM, 4 mM Hx 농도의 0.3% BSA 배양액과 10% FBS 배양액에서 난자의 성숙억제양상을 비교해 보면 4 mM 농도의 Hx 배양액에서 18시간 동안 완전한 성숙억제를 보였다. 2 mM 농도의 Hx 배양액에서도 18시간 배양까지 억제를 보였으나 4 mM 농도의 Hx 배양액보다 작은 난자성숙억제양상을 보였다. 1 mM 농도의 Hx 배양액에서는 모두 난자성숙억제를 보이지 못했다. FSH를 첨가한 배양액에서는 2 mM 농도의 Hx 뿐만 아니라 1 mM 농도의 Hx 첨가에서도 초기 3시간까지 GVBD 성숙이 억제되었다. 또 같은 농도의 Hx을 함유하고 FSH를 첨가하지 않은 배양액에 비해 FSH를 첨가한 배양액에서 3시간, 6시간 동안 GVBD 발생을 더 억제하였다. 그러나 18시간 배양 후 난자성숙이 회복됨을 보였다. 이 결과로 FSH가 배양초기에 난자성숙을 억제하나 후기에는 성숙을 촉진함을 알 수 있었다. 18시간 후 MII기발육은 4 mM 농도의 Hx을 함유한 모든 배양액에서 낮은 발생률을 보였고, FSH를 함유한 10% FBS 배양액에 1 mM, 2 mM의 낮은 농도의 Hx을 첨가한 배양액은 다른 배양액에 비해 통계학적으로 높은 MII기 발생률을 보였다. 결 론: 본 실험에서 낮은 농도의 Hx과 FSH는 FBS를 함유한 배양액에서 미성숙난자의 초기배양 동안 성숙을 억제한 후 MII기 성숙을 촉진함을 알 수 있었다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제30권2호
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• pp.73-82
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• 2015

This study was designed to evaluate the possibility of increase through dairy female offspring's ratio by transfer of pre-selected transferrable blastocyst that was produced by pre-selected X-bearing semen with OPU derived oocytes. Elite dairy female cow is demanded strongly compared with male, the so called, farmer wants to produce only an elite female dairy offspring as a candidate female dairy cow for producing milk. In our study, we selected 2 elite dairy bull semen from National Agricultural Cooperative Federation to pre-select X-bearing semen and 5 elite dairy female cows as donor for collecting of OPU derived oocytes. OPU derived embryo production system was carried out an aspiration of immature oocytes from 5 donor cows 2 times per week, total 200 times for 2 to 7 months by an ultrasonographic guided follicular aspiration system and then produced in vitro-produced blastocysts by in vitro maturation, fertilization and culture. Dairy donor semen selected H-319, 320 bull in National Agricultural Cooperative federation was sorted X-bearing semen by flow-cytometer and frozen for using IVF with OPU derived oocytes. Donor cows were selected 5 elite dairy cows from Gyeongju Dairy Cow Community and then disease tests such as 4 kinds of disease before selecting was checked. Oocyte proportion of grade 1 to 3 from total collected oocytes was significantly lower in donor A and B than those in donor C, D and E (82.16 and 70.03% vs. 90.0, 91.78 and 93.57%), respectively (p<0.05). However, number of oocytes per session in donor A, C and E was significantly higher than those in donor B and D ($7.77{\pm}3.26$, $5.85{\pm}2.10$ and $7.03{\pm}2.14$ vs. $4.68{\pm}2.61$ and $5.21{\pm}1.97$ oocytes), but donor A was significantly higher than donor C (p<0.05). Development to blastocyst in donor B, C and E was significantly higher than those in donor A and D (31.0, 25.0 and 25.0% vs. 14.3 and 4.5%), but donor A was not different in donor C and E (p<0.05). Nine out of 10 blastocysts (90.0%) derived from OPU blastocysts were confirmed male embryos that was induced with Y-bearing semen to confirm sex ratio only. Total 96 blastocysts derived from female bearing semen were transferred into synchronized recipients and then confirmed 42 recipients (43.8%) pregnancy rate, 36 offspring (37.5%) and 91.7% female sex ratio (33 female vs. 3 male offspring). Taken together all data, elite dairy female offspring could be produced effectively by in vitro production system between pre-selected x-bearing semen and OPU derived oocytes that would be influential breeder in the breeding of dairy farm to increase effectively elite dairy offspring ratio as well as net income in the dairy farmer.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제33권3호
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• pp.157-162
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• 2009

This study was performed to comprehend the developmental characteristics of cloned embryos knocked out (KO) of $\alpha$-1,3-galactosyltransferase (GalT) gene. Immature oocytes were collected and cultured for 40 hrs (1-step) or 20hrs (with hormone) + 20hrs (without hormone) (2-step). The embryos transferred with miniature pig ear fibroblast cell were used as control. The reconstructed embryos were cultured in PZM-3 with 5% $CO_2$ in air at $38.5^{\circ}C$ for 6 days. To determine the quality of the blstocysts, TUNEL and quantitative realtime RT-PCR were performed. The embryos were transferred to a surrogate (Landrace) at an earlier stage of the estrus cycle. The maturation rate was significantly higher in 2-step method than that of 1-step (p<0.05). The blastocyst development of GalT KO embryos was significantly lower than that of normal cloned embryos (p<0.05). The total and apoptotic cell number of GalT KO blastocysts was not different statistically from control. The relative abundance of Bax-$\alpha$/Bcl-xl ratio was significantly higher in both cloned blastocysts than that of in vivo blastocysts (p<0.05). Taken together, it can be postulated that the lower developmental potential and higher expression of apoptosis related genes in GalT KO SCNT embryos might be a cause of a low efficiency of GalT KO cloned miniature pig production.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제22권8호
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• pp.1117-1123
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• 2009

This study investigated the effects of IGF-I and EGF on the development of blastocysts or hatched blastocysts during the in vitro culture of embryos from immature porcine oocytes. After the in vitro maturation and fertilization of cumulus-oocyte complexes (COCs) and their culture in vitro in PZM3 medium, we examined the embryo development rate for 168 h. When different concentrations of IGF-I (0, 1, 10, 20 ng/ml) were supplemented to fertilized porcine embryos in vitro, there were no significant differences in cleavage rate, blastocyst development rate or blastocyst hatching rate among the treated groups. On the other hand, when different concentrations of EGF (0, 1, 10, 20 ng/ml) were supplemented to the in vitro culture medium, blastocyst development rate was highest in the group in which EGF was not supplemented and, specifically, it was higher than in the 20 ng/ml treatment group (p<0.05). When 10 ng/ml IGF-I and 1 ng/ml EGF were supplemented separately or simultaneously, there were no significant differences among the treated groups in blastocyst hatching rate and the number of cells in each condition. This study demonstrated that the addition of IGF-I and EGF into PZM3 medium did not enhance development of the blastocyst stage and total cell number in blastocysts.

• 환경생물
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• 제41권3호
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• pp.298-307
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• 2023

이 연구에서는 우리나라 서해안에 서식하는 쏙 (U. major)과 가시이마쏙(A. wuhsienweni) 암컷의 연중 번식 주기를 조직학적 방법을 이용하여 조사하였다. 채집된 시료는 연령에 따른 성숙 및 번식생태 차이가 있는지 알아보기 위해 두흉갑장(carapace length, CL)을 기준으로 성체와 어린 개체로 구분하여 분석하였다. 두흉갑장 25 mm 미만의 어린 쏙(U. major)의 경우에는 생식소 발달단계가 대부분 연중으로 초기발달기(62~100%)와 후기발달기(10~38%)로 관찰되어 번식에 참여하지 않는 것으로 확인된 반면, 두흉갑장 25 mm 이상의 성체 쏙의 경우에는 뚜렷한 계절적 변화 패턴이 관찰되었다. 성체 쏙의 생식소 발달단계는 11월에서 이듬해 3월까지 초기발달기와 후기발달기가 관찰되고, 완숙기의 성숙난은 4월부터 10월까지 관찰되었다. 두흉갑장 15 mm 이상 가시이마쏙 성체의 경우에는 생식소 내 완숙된 성숙난이 연중 관찰되었으며, 완숙기는 1월부터 6월까지로 관찰되었다. 반면, 두흉갑장 15 mm 이하 어린 가시이마쏙의 경우에는 연중 미성숙 상태를 유지하였다. 우리나라에 서식하는 두 종의 쏙류는 암컷 성체의 생식소 성숙기간이 다른 것으로 조사되었으며, 또한 외포란 시기도 쏙은 월에서 4월, 가시이마쏙은 6월에서 9월로 전혀 다른 성 성숙 주기를 지닌 것으로 확인되었다. 이 연구는 조직학적 방법을 이용한 국내 서식 쏙류의 번식 주기를 최초로 구명한 연구로 쏙류의 생리생태를 이해하는데 중요한 기초자료로 활용될 것으로 기대되며, 패류 양식장 내 쏙류의 구제 방안 도출을 위한 기초자료로 활용될 것으로 기대된다.