표고버섯에는 다양한 효능성분들이 존재하며 특히, β-glucan과 polyphenol 성분들은 항산화, 광노화, 주름개선 등의 피부개선 효능이 알려져 있다. 본 연구에서는 표고버섯 물 추출물에서 polyphenol과 β-glucan 함량을 확인하였으며 이러한 연구결과를 바탕으로 피부노화 억제효능을 조사하였다. Scratch wound healing assay를 통해 표고버섯 물 추출물 처리시 자외선 조사에 의해 손상된 HaCaT cell의 증식 유도 효과를 확인하였다. 또한 세포 내 생성된 ROS를 효과적으로 소거함으로써 세포 내 과도한 산화 스트레스를 줄여 다양한 염증성 사이토카인의 유발을 억제하고 피부노화 인자의 발현을 억제하는 것으로 생각된다. 세포 외 기질과 단백질을 분해하는 MMPs의 발현양상을 확인한 결과 표고버섯 물추출물은 MMP-1과 MMP-9의 발현을 억제하였으며, type I collagen의 생합성을 증가시켰다. 이를 통해 표고버섯 물 추출물은 세포를 활성화시켜 세포의 이동 및 증식을 유도함으로써 피부를 재생 및 collagen 합성을 촉진하고 collagen 분해 인자를 억제시킴으로써 피부의 주름억제 활성에 효능을 가지는 것으로 확인되었다. 따라서 본 연구를 통해 표고버섯 물 추출물은 화장품 분야에서 피부 노화 예방 및 개선소재로서의 개발 가능성을 확인하였다.
본 실험에서는 안전하고 우수한 효과를 지닌 천연항산화제의 광노화에 의한 피부주름 형성을 억제하는 천연물질을 탐색하기 위한 연구의 일환으로 CTL80의 식이투여와 로션 도포가 광노화를 유발한 동물모델에서 주름 형성에 미치는 영향을 살펴보았다. 광노화 유발 동물모델을 만들기 위해 hairless mice에 10주 동안 UVB 조사를 주 3회 실시하였다. 형태학적 변화를 관찰한 결과 UVB를 조사한 군은 각질이 증가하고 주름 능선의 두께가 굵고 주름이 깊게 형성한 반면, 양성대조군인 비타민 C와 CTL80 처리한 군에서 주름 형성이 감소하였으며, 특히 2% CTL80 로션 도포군이 가장 주름 형성을 억제하였다. 피부조직의 H&E 염색을 통한 조직학적인 변화에서는 UVB 조사로 두꺼워진 각질층과 표피층을 관찰하였으며 진피층의 교원섬유가 감소되었음이 관찰되었다. CTL80은 각질층과 표피층의 증가를 감소시켰으며 진피층의 교원섬유를 증가시켰음을 관찰하였다. 형태학적 변화와 같이 2% CTL80 로션 도포군의 효과가 가장 양호하게 나타났다. 항산화 상태에 미치는 영향을 살펴보기 위해 동물 혈청의 SOD와 GSH-Px의 활성을 측정한 결과, 비타민C와 CTL80처리 군에서 UVB만 조사한 군에 비하여 활성이 유의적으로 높아졌음을 살펴볼 수 있었다. 항산화 활성 또한 CTL80에 농도 의존적이지는 않았으나 식이 투여군에 비하여 로션 도포군에서 높은 활성을 보였다. 교원질 합성을 억제하고 분해를 촉진시키는 MMPs(MMP-1, MMP-3, MMP-9)의 발현을 실시간 정량 PCR로 측정하여 발현 변화를 살펴보았다. 그 결과 식이 투여군과 로션 도포군 모두 UVB 조사군에서는 발현이 현저히 높아졌으나 비타민 C와 CTL80 처리 군에서 유의적으로 낮아졌음을 살펴볼 수 있었다. 특히 CTL80 로션 도포군에서 MMP-9의 발현이 확연히 낮아졌음을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과를 통하여 CTL80은 높은 항산화 활성을 지녔으며 이러한 항산화능을 통하여 UVB로 광노화를 유발시킨 동물모델에서 주름 생성 억제에 긍정적인 영향을 미쳤고 주름 억제 효능을 지니는 기능성 소재로써 개발 가능성을 확인하였다.
신생혈관형성을 억제하는 것은 최근들어 많은 고형암의 치료에 있어서 매우 유용한 접근 방법이다. 현재까지 가장 잘 알려진 접근 방법은 신생혈관형성의 핵심인자인 혈관내피세포성장인자(VEGF)를 표적으로 하는 방법이다. 다양한 화학예방 물질들을 포함하는 많은 자연의 생산물들이나 추출물들은 그들의 항신생혈관형성 성질을 통하여 악성종양의 성장을 억제하고 있다. 황백은 항종양, 항균, 항염증 및 그외 다른 생물학적 작용을 가지고 있는, 오래전부터 널리 사용되어온 한국 전통 약재이다. 우리는 종양의 성장, 침투, 전이에 있어서 매우 중요한 과정인 신생혈관형성에 미치는 황백 온수추출물의 효과를 연구하였다. 황백 온수추출물의 항신생혈관형성 효과를 확인하기 위해서 혈관 내피세포의 성장, 이동, 침투, 관형성 그리고, 자이모그램 분석을 수행하였으며, 흰쥐 대동맥 주변 미세혈관 발아실험을 진행하였다. 그 결과, 황백 온수추출물은 혈관내피세포성장인자(VEGF)에 의해 유도되는 혈관내피세포의 성장, 이동, 침투, 관형성 그리고, 대동맥의 혈관발아를 억제하는 효과를 in vitro와 ex vivo 실험을 통해서 확인하였다. 또한, 황백 추출물은 VEGF에 의해 유도되는 기질금속단백질분해효소 (MMP)-2와 -9의 활성화를 저해하였다. 본 연구 결과들은 황백 온수추출물의 신생혈관형성 억제작용이 암과 같은 혈관신생과 관련된 질병을 치료하는데 좋은 소재가 될 수 있음을 시사한다
본 실험에서는 primary culture된 연골세포 in vitro 실험모델과 MIA로 유발한 골관절염 in vivo 실험모델을 이용하여 보스웰리아 추출물의 골관절염 예방 효과를 확인하였다. 먼저 MTT 시험법을 통해 세포 사용 적정농도를 $20{\mu}g/mL$ 이하로 결정하여 연골세포 사멸 억제를 확인하고, 이를 근간으로 골관절염 동물실험 모델에서 골관절염 예방 효과를 확인하였다. $H_2O_2$ 처리에 따른 산화적 독성으로 연골세포 사멸을 유도한 실험에서 보스웰리아 추출물은 유의적으로 세포사멸을 억제하였으며 이러한 효과는 $5{\sim}20{\mu}g/mL$ 사이농도에서 비교적 높게 나타났다. 세포실험에서는 골관절염 발병에 따라 관절연골에 영향을 미치는 염증인자에 대한 기전연구를 진행하였으며, 연골세포에 LPS를 처리하여 염증을 유도한 후 보스웰리아 추출물의 효과를 확인한 실험 결과 면역과 염증반응을 조절하는 nuclear transcription factor ${\kappa}B(NF{\kappa}B)$, 염증관련 cytokine IL-6, TNF-${\alpha}$의 발현이 모두 보스웰리아 추출물 처리 시 유의적으로 감소하는 것으로 나타났으며 특히 $20{\mu}g/mL$ 농도에서 가장 효과가 뚜렷하고 일관되게 확인되었다. 또한 이들 cytokine에 의해 생성되는 COX-2 발현과 COX-2에 자극 받아 생성이 촉진되는 PGE2 생성을 확인한 결과 역시 $20{\mu}g/mL$ 농도에서 가장 효과적으로 생성이 억제되어 염증을 조절하는 것으로 나타났다. 특히 보스웰리아의 기능성분으로 알려진 보스웰릭산(boswellic acids)에 의해 억제되는 5-LO의 경우, 염증반응 유발의 핵심인자를 생성하는 효소로 알려져 있으며 이를 직접적으로 저해하는 것으로 알려진 보스웰리아의 효능을 확인 하고자 실험을 진행하였다. 실험 결과 염증을 유도한 연골세포에서 보스웰리아 추출물의 처리에 따라 5-LO 활성이 감소하였으며, 이는 곧 보스웰리아 추출물이 염증을 유발 핵심효소인 5-LO 활성을 효과적으로 억제함으로써 연골세포 보호 효과를 나타낸 것이다. 세포실험에서의 기전 결과를 바탕으로 골관절염을 유발한 동물모델에서의 보스웰리아 추출물의 섭취에 따른 효과가 나타날 것으로 기대되어 관절염 유발 동물모델에서 보스웰리아 추출물의 효능검증 실험을 진행하였으며, 세포실험 결과 및 기존의 연구내용을 참고하여 동물에서 보스웰리아의 섭취 농도를 50 mg/kg, 100 mg/kg 및 200 mg/kg으로 결정하고 AIN-93G diet에 보스웰리아 추출물 분말을 섞어 보스웰리아 diet를 제작하여 실험기간 동안 제공하였다. 골관절염 유발 동물모델을 만들기 위해 SD rat의 관절강에 MIA를 injection 하였으며, 보스웰리아 추출물 섭취에 따른 관절염 예방 효과를 관찰하기 위해 관절염 유발 2주일 전부터 제작된 식이를 제공하고 유발 후 3주간 지속적으로 식이 제공 및 관찰하였다. 연골의 주요 구성 성분인 collagen 및 aggrecan은 골관절염 발병 시 여러 인자에 의해 분해되는 것으로 알려져 있으며, 골관절염 유발동물모델에서 collagen type I, collagen type II 및 aggrecan 유전자 발현을 실시간 정량 PCR로 측정하여 변화를 살펴보았다. 그 결과 골관절염 유발 sham군에 비해 보스웰리아 추출물 섭취군에서 유의적으로 collagen type I, collagen type II 및 aggrecan 발현이 증가하였으며, 특히 BW200군에서 CLX 약물대조군과 비슷한 수준으로 발현이 증가하여 관절연골의 보호 효과가 가장 좋은 것으로 확인되었다. 교원질 합성을 억제하고 분해를 촉진시키는 MMPs(MMP-3, MMP-9, MMP-13)의 발현을 실시간 정량 PCR로 측정하여 발현 변화를 살펴보았다. 그 결과 앞선 다른 실험 결과와 마찬가지로 보스웰리아 섭취군에서 MMPs 유전자 발현이 유의적으로 낮아졌음을 살펴볼 수 있었다. 특히 BW200군에서 MMPs 발현이 유의적으로 감소하였으며, 관절염에 효과적으로 사용되는 약물인 CLX 투여 양성대조군과 비슷한 수치를 나타내었다. 이상의 결과를 통하여 보스웰리아 추출물은 골관절염에서 관절연골의 보호 효과가 있으며, 이는 골관절염 발생 시 나타나는 염증발현의 기전적인 측면뿐만 아니라 골관절염 유발 동물에서 섭취 효능까지 모두 일관되게 나타나 골관절염에서의 기능성 소재로써 개발가능성이 충분할 것으로 생각된다. 또한 추후 실험을 통해 골관절염이 유발된 동물에서 보스웰리아 추출물 섭취 시 관절연골의 형태학적인 변화 및 골상태의 분석과 더불어 관절염 유발 동물의 관절연골 및 혈액학적 분석을 진행하여 동물에서 기전적 측면을 보완하고 보스웰리아 추출물 효능에 대한 추가적인 검증을 하고자 한다.
연구배경 : 폐 섬유화증의 진행에는 세포외 간질의 대사에 관여하는 gelatinase가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, gelatinase의 작용은 사이토카인을 비롯한 여러 가지 요소에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. 지금까지 $interferon-{\gamma}$($IFN-{\gamma}$)는 폐섬유화를 억제하는 것으로 알려져 있지만 gelatinase의 작용에 $IFN-{\gamma}$가 미치는 영향은 잘 밝혀져 있지 않다. 이에 저자들은 bleomycin 유도 백서 폐 섬유화 모델에서 $IFN-{\gamma}$가 폐 섬유화에 미치는 영향과MMP-2, -9과 이의 길항제인 TIMP-1, -2 그리고 Th-2 사이토카인의 변화에 미치는 영향을 조사함으로써, $IFN-{\gamma}$가 폐 섬유화증에 미치는 영향과 기전을 연구하고자 하였다. 재료 및 방법 : Sprague-Dawley계의 수컷 흰쥐를 정상 대조군, bleomycin 군, bleomycin+$IFN-{\gamma}$ 군의 세 군으로 나누어, bleomycin 군 과 bleomycin+$IFN-{\gamma}$ 군은 bleomycin sulfate를 생리식염수에 섞어 기관 내로 주입하였고(6 U/kg), bleomycin+$IFN-{\gamma}$ 군은 $IFN-{\gamma}$를 14일간 근육주사 하였다($2{\times}105U/kg$). 실험동물은 3, 7, 14, 28일에 폐를 얻어 hematoxylineosin 염색과 Masson's trichrome 염색을 하여 폐의 염증 반응과 섬유화 정도를 관찰하였고, 폐 조직 내의 hydroxyproline 함량, MMP-2, -9, TIMP-1, -2에 대한 Western blot, zymography와 reverse zymography, IL-4와 IL-13에 대한 ELISA검사를 시행하였다. 결 과 : 1. 폐 염증은 bleomycin 투여 7일째에는 $IFN-{\gamma}$를 투여한 경우 더 심하게 일어났으나(bleomycin 군 : bleomycin+$IFN-{\gamma}$ 군=$2.08{\pm}0.15:2.74{\pm}0.29$, P<0.05), 폐 섬유화는 bleomycin 투여 후 28일째 $IFN-{\gamma}$ 투여에 의해 유의하게 감소되었다(bleomycin 군 : bleomycin+$IFN-{\gamma}$ 군=$3.94{\pm}0.43:2.46{\pm}0.13$, P<0.05). 2. 폐 내 hydroxyproline 함량은 bleomycin 투여 28일 후 $IFN-{\gamma}$ 투여에 의해 유의하게 감소되었다(bleomycin 군 : bleomycin+$IFN-{\gamma}$ 군=$294.04{\pm}31.73{\mu}g/g:194.92{\pm}15.51{\mu}g/g$, P<0.05). 3. Bleomycin 투여에 의해 MMP-2 단백질의 양이 증가되는 소견이 Western blot에서 관찰되었는데 MMP-2의 증가는 bleomycin 투여 14일에 최고에 이르렀으며, $IFN-{\gamma}$의 투여에 의해 bleomycin에 의한 MMP-2의 증가는 억제되었으나 대조군 수준으로 감소하지는 않았다. 4. Zymography 검사에서 bleomycin 투여 3일째에는 활성화된 형태의 MMP-2가 $IFN-{\gamma}$에 의해 유의하게 증가되었으나(bleomycin 군 : bleomycin+$IFN-{\gamma}$ 군=$209.63{\pm}7.60%:407.66{\pm}85.34%$, P<0.05), 투여 14일 후에서는 $IFN-{\gamma}$에 의해 활성화된 상태의 MMP-2가 유의하게 감소되었다(bleomycin 군 : bleomycin+$IFN-{\gamma}$ 군=$159.36{\pm}20.93%:97.23{\pm}12.50%$, P<0.05). 5. Bleomycin을 투여한 후 bleomycin 군과 bleomycin+$IFN-{\gamma}$ 군 모두에서 IL-4의 양이 감소되었으나, 두 군간 차이는 통계적으로 유의하지는 않았고, IL-13은 별 다른 차이가 없었다. 결 론 : Bleomycin에 의한 백서 폐 섬유화 모델에서 $IFN-{\gamma}$는 초기 폐 염증을 증가시키지만 후기 폐 섬유화는 억제시킨다는 것을 알 수 있었다. $IFN-{\gamma}$가 폐 섬유화를 억제하는 것은 MMP-2의 활성화를 억제하기 때문인 것으로 생각한다. 또한 $IFN-{\gamma}$에 의한 MMP-2의 기능 억제는 Th-2 사이토카인을 억제하여 이루어지는 것 같지는 않았다. 본 논문을 기초로 향후 $IFN-{\gamma}$가 MMP-2의 활성화를 조절하는 기전과 MMP-2의 활성화가 폐섬유화에 미치는 영향에 대한 연구가 필요할 것으로 생각한다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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