김치로부터 Listeria spp.를 억제하는 박테리오신을 생산하는 젖산균 4균주를 선발하여 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides (2균주), Leuconostoc paramesenteroides 및 Pediococcus pentosaceus로 동정하였다. 실험한 모든 Listeria monocytogenes 균주들은 모든 분리 균주의 박테리오신에 의해 억제되었으나, L. denigrificans 28과 L. welchimeri 89는 Leu. paramesenteroides 분리균주에 의해 억제되지 않았다. 분리균주들 중에서 P. pentosaceus의 박테리오신이 가장 항균활성이 높았고, 항균범위도 넓었다. Leuconostoc 분리균주들의 박테리오신의 항균활성은 pronase E에 의해 완전히 불활성화 되었으나 P. pentosaceus의 것은 완전히 불활성화되지 않았다. 분리균주들의 박테리오신은 catalase, ${\alpha}$-amylase, lysozyme 및 $100^{\circ}C$ 30분의 열처리에 대해서 안정하였다.
김치로부터 Leu. paramesenteroides의 야생균주 Pw를 분리하여 내산성 변이균주 P-100으로 개량하였다. 야생균주 Pw는 HCI로 조정한 pH 4.0이상에서부터 증식하였으며, 유기산 혼합용액으로 조정한 pH 4.0에서는 증식하지 못하였다. 변이균주 P-100은 HCI로 조정한 pH 3.8 이상부터 증식하였으며, 유기산 혼합용액으로 조정한 pH 4.0에서부터 증식하였다. 내산성으로 개량한 변이균주 P-100과 야생균주 PW를 starter로 김치에 첨가하여 1$0^{\circ}C$에서 발효시킨 결과를 보면, 무첨가군에 비해 야생균주 Pw 첨가군은 2.25배, 변이균주 P-100 첨가군은 2.67배 정도의 산패지연 효과를 나타내었다. 유기산 함량의 변화에서도 숙신산 및 아세트산 함량이 변이균주 P-100 첨가군과 야생균주 Pw 첨가군에서 무첨가군에 비해 상대적으로 높고, 젖산의 함량은 상대적으로 낮았다. 관능검사에 있어서 전체적인 기호도의 경우, 숙성 21일째 첨가군에서 무첨가군보다 매우 높은 기호도 점수(4.0)를 얻었다. 김치 발효 기간중 Leuconostoc 속 균수는 내산성 변이균주 P-100 첨가군, 야생균주 Pw 첨가군, 그리고 무첨가군의 순이였으며, Lactobacillus 속 균수는 이와 반대를 보여 lactobacillus 속 균이 생육억제됨을 확인하였다. 이상 젖산 발효균으로서 산 생성 수율이 낮고 풍미 향상에 기여할 수 있는 내산성 변이균주 Leu. paramesenteroides P-100을 starter로 첨가함으로써 발효말기까지 Lac. plantarum과 경쟁적으로 생육이 가능하여 김치 가식 기간의 연장과 함께 기호도가 증대되는 것을 확인할 수 있었다.
백김치를 담근 후 15$^{\circ}C$에서 60일간 밀폐상태로 발효시키면서 발효일수 경과에 따른 pH, 총산함량 및 미생물수의 변화를 조사하고, 주요 미생물군집을 분리.동정하였다. 담금 즉시의 김치는 pH 6.15, 총산 0.03%였고, Gram 음성 간균류가 치우점 미생물이었으며 이들의 주요 속 구성은 Pseudomonas 55%, Enterobacter 40%, Erwinia 5%였다. 젖산균은 발효 2일 이후부터 최우점 미생물이 되었으며, 발효 4일, 12일 및 50일에 젖산균의 1차, 2차 및 3차 정상기를 각각 나타내었다. 젖산균 2차 정상기의 김치는 pH 3.51, 총산 0.59%로 적숙상태에 해당되며, 이 때 주요 젖산균의 종 구성은 Lactobacillus bavaricus 55%, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides 42.5%, Leuconostoc paramesenteroides 2.5%였다. 젖산균 3차 정상기의 김치는 pH 3.40, 총산 1.10%로 과숙상태에 해당되며, 이 때 주요 젖산균의 종 구성은 Lactobacillus plantarum 65%, Lactobacillus brevis 35%였다. 젖산균들을 동정할 때에 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc paramesenteroides, Lactobacillus plantarum 및 Lactobacillus brevis로 동정된 균주들은 기존의 분류체제에 비교적 잘 일치하였으나, Lactobacillus bavaricus로 동정된 균주들은 일치하지 않는 점들을 많이 나타내었다. 젖산균의 수가 증가할 때에 효모의 수가 감소하였고, 젖산균의 수가 감소할 때에 효모의 수가 증가하였다. 효모의 정상기는 젖산균이 제2정상기와 제3정상기의 사이인 30일에 나타났으며, 이 때 주요 효모의 속은 모두 Saccharomyces였다.
김치발효에 관여하는 균종들에 대해 항균작용이 있는 것으로 알려진 adipic acid를 김치제조시 첨가하고, 동시에 adipic acid 저항성 변이균주인 Leuconostoc mesenteroides와 Leu. paramesenteroides 두 균주를 김치에 starter로서 첨가하여 발효시키므로써 김치의 저장기간 연장과 풍미증진 효과를 조사하였다. 또한 이를 위한 변이균주의 최적의 첨가량을 조사하였다. 김치발효의 주요 숙성균주로서 산에 약한 Leu. mesenteroides와 Leu. paramesenteroides 두 균주를 adipic acid에 대한 저항성을 갖도록 변이시킨 후 adipic acid 0.16%와 함께 두 변이주를 각각 단독으로 또는 두 변이균주의 혼합균주(1 : 10)로서 김치제조시 starter로 첨가한 경우. 단독첨가 보다는 혼합균주인 경우가 산패지연 효과와 관능특성 면에서 우수하였으며 혼합균주의 최적 첨가량은 0.005%로 조사되었다.
Adipic acid에 대해 저항성을 갖도록 변이된 Leuconostoc paramesenteroides (ANaP100) 균주의 내산성 특성을 조사하기 위하여 수소이온 투과도, $H^+-ATPase$ 활성, $Mg^{++}$ 해리도, 원형질막의 지방산 조성을 지표로 삼아 야생균주(LPw)와 비교하였다. 수소이온 투과도의 경우 pH 5에서 $t_{1/2}$ 값이 LPw는 4.3분, ANaP100은 4.8분으로서 변이균주가 다소 내산성이 높았으며 $H^+-ATPase$ 활성은 maximal activity가 Leu. paramesenteroides는 모두 pH 6.0에서 가장 높았고 LPw는 0.59 unit/mg protein, 변이균주는 0.63 unit/mg protein으로서 ANaP100이 LPw보다 활성이 높았다. 세포막의 산 손상(acid damage)에 의한 $Mg^{++}$ 해리도에서도 pH 4.0에서 2시간 경과 후 LPw는 52.2%, ANaP100은 27.3%로서 LPw에 비해 약 1/2가량 $Mg^{++}$이 적게 유출되어 산에 의한 세포막의 손상이 적었다. 원형질막의 지방산 조성은 ANaP100가 $C_{18:1}$은 감소하고, $C_{19:0,\;cyclo}$는 증가하여 내산성이 증대되었으며 또한 adipic acid 첨가시에도 LPw에 비해 우수한 증식을 보였다. 따라서 ANaP100이 LPw에 비해 내산성이 증가되었으며 adipic acid 저항성도 함유하는 것이 확인되었다.
본 연구에서는 시판 김치로부터 분리된 젖산균을 동정하였다. 제조 후 4일 동안 실온에서 배양된 배추김치에서 12주, 2일 동안 실온에서 배양한 총각김치에서 6주, 5일 동안 실온에서 배양한 깍두기에서 15주, 그리고 4일 동안 배양한 파김치에서 23주의 젖산균이 분리되었다. 배추김치에서 분리된 12주의 젖산균 중 8주는 Lactobacillus plantarum로, 1주는 Leuconostoc lactis로, 2주는 Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum으로, 그리고 1주는 Lactobacillus sake로 동정되었다. 총각김치에서 분리된 6주의 젖산균 중 3주는 Leuconostoc paramesenteroides로, 2주는 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides로, 그리고 1주는 Lactobacillus plantarum로 동정되었다. 깍두기에서 분리된 15주 중 2주는 Leuconostoc lactis로, 3주는 Leuconostoc mesenteroides subsp. dextricum로, 4주는 Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum로, 그리고 4주는 Lactobacillus coryniformis subsp. torquens로 동정되었다. 파김치에서 분리된 23주 중 22주는 L. plantarum으로 그리고 1주는 Lactobacillus sake로 동정되었다. 이상의 결과로부터, 배추김치에서는 L. plantarum이, 총각김치에서는 L. paramesenteroides이, 깍두기에서는 L. casei subsp. pseudoplantarum과 L. coryniformis subsp. torquens이, 그리고 파김치에서는 L. plantarum이 가장 많이 동정되었다. 특히 파김치에서는 선발된 23주 중 1주를 제외하고는 모두 L. plantarum으로 동정되었다.
본 연구는 시판 배추김치, 총각김치, 깍두기 및 파김치에서 분리한 젖산균을 $15^{\circ}C$와 $25^{\circ}C$의 온도에서 배양하였을 때 아질산염의 소거 효능을 확인하였다. $15^{\circ}C$에서, 시판김치에서 분리된 젖산균은 L. mesenteroides subsp mesenteroides와 L. paramesenteroides를 제외하고는 매우 활성적으로 아질산염을 소거시켰다. 특히 L. mesenteroides subsp dextrinicum과 L. lactis는 아질산염에 적응하는 기간을 필요로 함이 없이 매우 활성적으로 아질산염을 소거시켰다. L. sake, L. plantarum, L. casei subsp. pseudoplantarum 및 L. coryniformis subsp. torquens는 하루 정도 아질산염에 적응하는 기간을 거친 이후에 매우 활성적으로 아질산염을 소거시켰다. L mesenteroides subsp. mesenteroides는 하루가 경과된 이후에 비교적 활성적으로 아질산염을 소거시켰다. 그러나 L. mesenteroides subsp. mesenteroides는 다른 균종에 비하여 매우 낮은 아질산염 소거율을 나타내었다. $25^{\circ}C$에서, 시판김치에서 분리된 모든 젖산균은 아질산염에 적응하는 기간을 필요로 하지 않았으며, L. paramesenteroides를 제외하고는 매우 활성적으로 아질산염을 소거하였다. 또한 시판김치로부터 분리된 젖산균은 L. mesenteroides subsp. mesenteroides와 L. paramesenteroides를 제외하고는 1일 이후에, L. mesenteroides subsp. mesenteroides는 2일 이후에 90% 이상의 아질산염을 소거시켰다. 그러나 L. paramesenteroides는 $25^{\circ}C$에서도 활성적이지 못하여 다른 균종에 비하여 아질산염의 소거 능력이 매우 낮았다. 한편, 다른 김치 기원의 동일 균종의 Lactobacilli와 L. mesenteroides subsp. mesenteroides 및 L. paramesenteroides를 제외한 Leuconostocs는 $15^{\circ}C$에서는 물론 $25^{\circ}C$에서 매우 활성적으로 아질산염을 소거시켰다.
김치에서 분리한 Leuconostoc속 4종 34주를 RAPD-PCR방법으로 분석하여 기존의 동정 결과를 비교 검토하였다. 상사도 0.5이상의 수준에서 L. mesenteroides subsp. mesenteroides 및 L. mesenteroides subsp. dextranicum균주들은 각 각 3 및 2의 cluster를 형성하였고 L. paramesenteroides 및 L. lactis는 각 각 하나의 cluster를 형성하였다. 각 각의 표준 균주들도 같은 종 혹은 아종의 cluster에 속하는 것으로 나타났다. 그러나 a 및 b cluster의 상사도는 0.2 이하의 수준이며 c cluster는 이들과 상사도가 더욱 낮아 L. mesenteroides subsp. mesenteroides 균주들은 유전적 상사도가 낮은 다양한 종류의 집단임을 추정 할 수 있었다.
Kimchi is a group of traditional fermented vegetable foods in Korea and known to be the product of a natural mixed-fermentation process carried out principally by lactic acid bacteria (LAB). According to microbial results based on conventional identification, Leuconostoc mesenteroides and Lactobacillus plantarum were considered to be responsible for the good taste and over-ripening of kimchi, respectively. However, with the application of phylogenetic identification, based on 16S ribosomal RNA gene similarities, a variety of Leuconostoc and Lactobacillus species not detected in the previous studies have been isolated, together with a species in the genus Weissella. Additionally, Lactobacillus sakei has been accepted as the most populous LAB in over-ripened kimchi. In this study, Leuconostoc and Weissella species inhibiting the growth of Lb. sakei were isolated from kimchi for future applications to do with kimchi fermentation. From 25 kimchi samples, 378 strains in the genera Leuconostoc and Weissella were isolated and 68 strains identified as Lc. mesenteroides, Lc. citreum, Lc. lactis, W. cibaria, W. confusa, and W. paramesenteroides exhibited growth inhibition against Lb. sakei. Most of the strains also had antagonistic activities against Lb. brevis, Lb. curvatus, Lb. paraplantarum, Lb. pentosus, and Lb. plantarum. Their antagonistic activities against Lb. sakei were more remarkable at lower temperatures of incubation.
김치 starter로 개량된 유기산내성 변이균주 L. paramesenteroides P-200이 갖는 강한 내산성에 관한 생리적 성질을 규명하기 위하여 proton 투과도, ATPase 활성, glycolysis 활성, $Mg^{++}$ 해리도, 세포막의 지방산 조성을 야생균주 (LP-W)와 비교 분석하였다. Proton 투과도 설험 결과 150 mM KCl 수용액 및 3% NaCl 수용액에서 변이균주 P-200의 $t_{1/2}$ 최대값이 pH 4.0, 5.0 그리고 6.0에서 모두 야생균주 LP-W 보다 2내지 3분 정도 더 큰 값을 가지며 실제 proton 투과도 실험에서 proton의 평형을 이루는 시간이 LP-W 보다 약 50% 정도 더 길었다. ATPase 활성의 결과에서도 최대 활성은 P-200이 pH 5에서 0.7unit/mg을, LP-W가 pH 6에서 0.6unit/mg을 나타내어, 산성 환경에서 P-200이 LP-W보다 더욱 높은 활성을 유지하였다. 또한 전체 pH 4-7 범위에서 P-200이 야생균주 LP-W 보다 높은 활성을 보였다. 해당작용의 pH 의존성 결과에서는 최대 활성이 P-200은 pH 4에서 97%이었고, LP-W는 pH 5에서 96%이었다 그리고 pH 5를 제외하면 측정한 pH 3-7 범위에서 LP-W에 비하여 P-200이 높은 해당작용 활성을 보였다. $Mg^{++}$ 해리도에 있어서는 pH 4에서 2시간 경과 후 P-200이 LP-W 보다 약 1/3 정도 $Mg^{++}$이 유출되었다. 지방산조성의 경우, LP-W에서 내산성을 증가시키는 $C_{19:0\;cyclo}$은 0%이었으나 P-200의 경우는 11.4%로 크게 증가하였다. 따라서 이상 5가지 내산성특성을 조사한 것 중 지방산조성에서 가장 큰 차이를 보였는데, 무엇보다 $C_{19:0\;cyclo}$가 0%에서 11.4%로 크게 증가하여 이러한 지방산 조성의 변화가 P-200이 LP-W 보다 더 강한 내산성을 가질 수 있었던 것에 가장 크게 기여하였을 것으로 생각되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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