Lactrococcus sp. HY449균줄르 M17-glucose broth에 배양하여 배양 상등액으로부터 propanol-actone 침전 ion-exchange chromatography gel-filtration chromatography 및 reverse-phase chroamtography 등을 통하여 비활성 25,600,000 BU/mg 인 순수한 bacteriocin 을 정제하였다. 정제 과정 주에서 ion-exchange chromatography 단계에 서는 35.3%의회수율이 7.3%로 감소하였다. Reverse-Phase chromatography에선 3.3%의 회수율을 보였고 활성도는 413.5배로 증가하였다. Tricine-SDS 전기영도 결과 bacteriocin 은 단일 밴드로 나타났으며, N-말단 아미노산 서열 분석을 수행한 결과 $NH_2$-IIe-Leu-Pro-GIn로 확인되었다. 아미노산조정 분석결과를 바탕으로 분자량을 예측한 결과 본 bacteriocin은 32개의 아미노산으로 이루어져 있으며 분자량은 3.6kDa인 것으로 추정되었다.
Han, Hyun-Ja;Lee, Nam Sil;Kim, Myoung Sug;Jung, Sung Hee
Fisheries and Aquatic Sciences
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제18권3호
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pp.333-339
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2015
Red lip mullet Chelon haematocheilus (body weight = $468{\pm}91g$) which became sick during an outbreak of disease at mariculture facilities at Cheonsu Bay, Korea, during July-August 2013, were examined to identify the cause of the disease. Diseased mullets displayed green liver syndrome, and Lactococcus garvieae were isolated from their internal organs. Argulus sp., Trichodina sp., and/or Vibrio spp. were also discovered in some infected fish. Histopathological examination revealed that fatty liver syndrome with hepatocyte degeneration, reflected in heterokaryons, inflammatory lesions, and melanomacrophage centers ($MMC_S$), had caused fibrosis around the kidney, spleen, and blood vessels. After the outbreak, visceral fat and green liver syndrome in the mullets were consistently observed throughout the year in the same mariculture facilities, indicating that the cultured mullets suffered a chronic metabolic disorder. Although Vibrio spp. were also isolated from some individuals, L. garvieae, which is known to be a causative agent of red lip mullet mortality, was isolated from all diseased individuals. This is the first report of L. garvieae infection in cultured red lip mullet.
Streptococcus sp J-C1 producing bacteriocin was isolated from Kimchi. The optimum conditions for bacteriocin production by Streptococcus sp. J-C1 were evaluated. For the maximum yield of bacteriocin production by Streptococcus sp. J-C1, the cell should be harvested at the late stationary phase and the temperature, pH and NaCl concentration should be 25$\circ$C, pH 8 and without the addition of NaCl, respectively. Sucrose should be used as a carbon source and organic nitrogen such as peptone should be used as a nitorgen source for the best yield. The production of bacteriocin is related to the cell growth of Streptococcus sp. J-C1. The bacteriocin from Streptococcus sp. J-C1 was active for gram positive microorganisms such as Lactobacillus sp., Leuconoctoc sp., Lactococcus sp., Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus amd Bacillus subtilis and also active for gram negetive bacteria such as Acetobacter aceti. Antibacterial activity of the bacteriocin was completely disappeared by protease treatment.
A food-grade integration vector based on site-specific recombination was constructed. The 5.7-kb vector, pIMA20, contained an integrase gene and a phage attachment site originating from bacteriophage A2, with the ${\alpha}$-galactosidase gene from Lactobacillus plantarum KCTC 3104 as a selection marker. pIMA20 was also equipped with a controllable promoter of nisA ($P_{nisA}$) and a signal peptide-encoding sequence of usp45 ($SP_{usp45}$) for the production and secretion of foreign proteins. pIMA20 and its derivatives mediated site-specific integration into the attB-like site on the Lactococcus lactis NZ9800 chromosome. The vector-integrated recombinant lactococci were easily detected by the appearance of blue colonies on a medium containing $X-{\alpha}-gal$ and also by their ability to grow on a medium containing melibiose as the sole carbon source. Recombinant lactococci maintained these traits in the absence of selection pressure during 100 generations. The ${\alpha}-amylase$ gene from Bacillus licheniformis, lacking a signal peptide-encoding. sequence, was inserted downstream of $P_{nisA}\;and\;SP_{usp45}$ in pIMA20, and the plasmid was integrated into the L. lactis chromosome. ${\alpha}-Amylase$ was successfully produced and secreted by the recombinant L. lactis, controlled by the addition and concentration of nisin.
손바닥선인장(Opuntia ficus-indica var. saboten Makino) 줄기 가수분해 분획물(MBT-01108)의 어병세균에 대한 in vitro 항균활성을 조사하였다. 실험에 사용한 어병세균은 Edwardsiella tarda, Listonella anguillarum, Vibrio sp., Lactococcus garvieae, L. raffinose, Streptococcus parauberis, S. iniae 등 총 18종이었다. 또한, oxytetracycline을 포함한 시판 항균제 disc를 MBT-01108의 항균활성에 대한 양성 대조군으로 하여 항균활성을 비교 조사하였다. 그 결과, MBT-01108은 실험에 사용한 어병세균들에 대하여 우수한 항균활성을 나타내었다.
원유로부터 bacteriocin을 생산하는 미생물을 분리하고 이 균주들을 중심으로 Lactobacillus plantarum을 target organism으로 하여 항균력을 비교하였다. 분리된 항균성물질들은 Gram양성 및 음성균에 대하여 넓은 항균 spectrum을 보였으며 선발균주 중 최종적으로 항균력이 가장 높은 1112-1을 우량균주로 선발하였다. 선발한 1112-2 균주의 항균성물질 230 IU/ml 첨가시에 Lactobacillus plantarum의 생육은 완전히 억제되었으며 500IU/ml 첨가시 E.coli의 생육은 대조구조에 비하여 11 억제되었다.
Bacteriocin을 생산하는 유산균을 김치에서 분리하였고 Lactococcus latis subsp. lactis로 확인 되었으며 bacteriocin의 최대생산조건은 $30^{\circ}C$, 6시간으로 다양한 유산균 및 Pseudomonas synsantha, Acetobacter aceti의 생육을 저해하였고 여러 peptidases에 의해 불활성화되었다. 또한 다양한 범위의 pH와 열처리에 안정하였고 SDS-PAGE결과 약 8 Kda으로 확인되었다.
세균성 어류질병의 치료 및 예방을 위하여 어류와 인체에 안전한 수산용 probiotic의 개발이 요구되고 있다. 본 연구에서는 남해안 일대에서 양식되고 있는 참굴 (Crassostrea gigas), 바지락 (Ruditapes philippinarum), 피조개 (Scapharca broughtonii), 새조개 (Fulvia mutica)의 가식 부위로부터 17균주의 candidate probiotic bacteria (CPB)를 분리하였다. 나아가 다양한 연쇄상구균 (Lactococcus garvieae, L. piscium, Streptococcus sp., S. iniae, and S. parauberis)에 대하여 강한 생장 억제력을 보이는 균주(CPB-St)를 선별하여 어류의 연쇄구균증 관리를 위한 probiotic 균주로서의 개발 가능성을 알아보았다. CPB-St 균주를 double layer test를 통하여 다양한 연쇄상구균들에 대한 생장 억제 정도를 알아보았으며, 혼합 배양에서의 Streptococcus sp.에 대한 생장 억제 능력을 확인하였고, CPB-St의 어류에 대한 안전성 및 장내 생존 유무를 평가하였다. CPB-St는 대부분의 연쇄상구균에 대하여 18~26 mm의 생장 억제대를 형성함으로써 높은 생장 억제 능력을 보였다. CPB-St와의 혼합 배양에서 Streptococcus sp.는 6시간째부터 생장 억제 현상이 관찰되기 시작하여 12시간 전후로 8~55배 정도의 감소를 나타내었다. CPB-St의 어류에 대한 병원성 유 무를 알아본 결과, 2주일 동안 CPB-St로 인한 어류 폐사는 관찰되지 않았다. CPB-St의 1회 강제 경구 투여 후, 위와 장에서 CPB-St의 생존을 확인한 결과 투여 24시간 후에는 CPB-St가 모두 배출되는 것으로 나타났다. CPB-St를 probiotic bacteria로 개발하기 위해서는 어류의 장내 정착 가능성과 먹이를 통한 효과의 정확한 검증이 추후 이루어져야 할 것이다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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