GM작물의 상용화를 위하여서는 반드시 환경위해성평가를 거쳐야 한다. 불행하게도 초기 event가 개발되고 기본적인 검토가 완료된 GM작물에 대하여 환경위해성평가를 수행하기 위하여서는 약 7백만에서 1,500만불의 경비가 소요되며 기간 또한 수년이 필요하다. 따라서 저자는 사용화를 위한 GM작물의 개발을 위한 프로젝트에 관여하는 개발자는 실험실 또는 온실단계의 아주 초기단계에서부터 환경위해성평가기준을 충분히 숙지하여야 한다고 제안한다. 기존의 많은 리뷰논몬에서 이미 지적된 것 과 같이 GM작물의 상용화과제에서 가장 큰 걸림돌(죽음의 계곡)은 초기 사상 (event)의 선발과정이며, 대부분이 이 단계에서 충분한 자료를 제시할 수 없어서 포기한다는 사실을 간과하여서는 안 될 것이다. 특히 지극히 기본적인 분자생물학 특성에 관한 자료들로서 예를 들어 도입유전자의 copy 수, 숙주의 게놈내 도입위치, 도입유전자의 주변 염기서열, 유전자 재배열과 도입유전자로 인한 숙주 내 기존유전자의 knock out 현상의 여부 등에 관한 충분한 자료를 제시하지 못하는 경우가 많으며 이는 GM 작물의 개발 초기단계에서부터 철저하게 검증이 이루어져야 하는 항목들이다. 국내의 경우, 농촌진흥청은 2011년부터 2020년까지 10년간 "차세대바이오그린 21 사업"을 발족하여 추진 중에 있으며 특히 국내용뿐만 아니라 중국의 사막화 지역 등 불량환경에 재배가 가능한 GM작물 등 해외로 수출을 위한 global GM작물의 개발을 위한 전략을 수립하여 추진 중에 있다. 따라서 저자는 환경위해성평가기준에 부합되는 초기 event의 선발 과정에 역점을 두어 사전에 분자생물학적 특성에 관한 RA기준을 고려하여 자체평가시스템을 도입하도록 제안 한다.
원시시대부터 인간의 커뮤니케이션 수단으로 이용되어 온 일러스트레이션은 이제 우리 생활 속에서 생활의 단편적이거나 혹은 심층적인 면을 함축하여 표현하는 수단이 되었다. 즉 그것은 피터 노크(Peter Knock)의 한 잡지 일러스트레이션을 보고 어떤 예술가가 '여태껏 읽은 것 중 가자 훌륭한 기사였다'고 말 한데서도 알 수 있듯이, 일러스트레이터의 임무는 하루의 일상생활에서 아니 순간 순간의 사물의 지각을 통한 비구체적이든, 구체적이든 일러스트레이션의 소스(source)가 우리의 잠재의식 속에 남아있다고 가정할 때 이들을 추출해서 사실적으로 묘사하는 작업을 하고 있다고 할 수 있고, 그것은 어떤 미사여구를 붙인 문자 언어보다도 강한 지각작용을 불러일으킬 수 있다는 것이다. 뿐만 아니라 일러스트레이션의 활용분야는 나날이 증가하고 있으며 그 대상도 인물, 자연, 인공, 과학 등 다양해지고 따라서 이러한 시점의 일러스트레이션에서 가장 요구되는 것은 얼마나 창조적이며 참신한 아이디어를 지녔냐 하는 것이다. 왜냐하면 복잡 다양한 사회 속에서 일반인의 마음속에 자리잡기 위해서는 보다 독특한 이미지와 호소력을 가져야 하기 때문이다. 따라서 일러스트레이션의 교육도 이젠 단순한 기술연마가 아닌 시넥틱스(Synetics)적 사고에 바탕을 둔 작품으로 유도되어야하며 기능 위주의 도식적인 일러스트이션 교육에서 벗어난 보다 자유롭고 풍부한 개성을 지닌 사고를 할 수 있도록 되어야 한다.
$I{\kappa}B$, a cytoplasmic inhibitor of nuclear factor-${\kappa}B$ ($NF-{\kappa}B$), is reportedly degraded via the proteasome. However, we recently found that long-term incubation with proteasome inhibitors (PIs) such as PS-341 or MG132 induces $I{\kappa}B{\alpha}$ degradation via an alternative pathway, lysosome, which results in $NF-{\kappa}B$ activation and confers resistance to PI-induced lung cancer cell death. To enhance the anti-cancer efficacy of PIs, elucidation of the regulatory mechanism of PI-induced $I{\kappa}B{\alpha}$ degradation is necessary. Here, we demonstrated that PI up-regulates nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2) via both de novo protein synthesis and Kelch-like ECH-associated protein 1 (KEAP1) degradation, which is responsible for $I{\kappa}B{\alpha}$ degradation via macroautophagy activation. PIs increased the protein level of light chain 3B (LC3B, macroautophagy marker), but not lysosome-associated membrane protein 2a (Lamp2a, the receptor for chaperone-mediated autophagy) in NCI-H157 and A549 lung cancer cells. Pretreatment with macroautophagy inhibitor or knock-down of LC3B blocked PI-induced $I{\kappa}B{\alpha}$ degradation. PIs up-regulated Nrf2 by increasing its transcription and mediating degradation of KEAP1 (cytoplasmic inhibitor of Nrf2). Overexpression of dominant-negative Nrf2, which lacks an N-terminal transactivating domain, or knock-down of Nrf2 suppressed PI-induced LC3B protein expression and subsequent $I{\kappa}B{\alpha}$ degradation. Thus, blocking of the Nrf2 pathway enhanced PI-induced cell death. These findings suggest that Nrf2-driven induction of LC3B plays an essential role in PI-induced activation of the $I{\kappa}B$/$NF-{\kappa}B$ pathway, which attenuates the anti-tumor efficacy of PIs.
저밀도 리포단백질 수용체 관련 단백질 5(LRP5)는 간과 췌장을 포함하여 많은 조직에서 발현하며 아포리포단백질 E와 결합한다. 이와 같은 LRP5 유전자의 체내 기능을 규명하기 위하여 LRP5 유전자가 결손된 생쥐를 개발하였다. 먼지 LRP5 genomic DNA는 TT2 ES 세포로부터 분리하였으며 LRP5 유전자의 엑손 18에 neo 유전자를 삽입한 vector를 구축하고 TT2 ES 세포에 도입하였다. 178개의 G418 내성을 보인 세포 중 상동유전자 재조합에 의하여 targeting vector가 LRP5 유전자 위치에 삽입된 clone은 3개였다. 키메라 생쥐는 상실배기 수정을 ES 세포와 응집시켜 생산하였으며 생산된 키메라 생쥐는 C57BL/6 생쥐와 교미를 유도하여 heterozygous를 얻었다. 또한 이들 heterozygous간의 교배에 의하여 LRP5 유전자 결손 생쥐를 생산하였다. 이러한 생쥐는 LRP5 유전자의 체내 기능연구에 있어서 모델로 이용될 것으로 생각된다.
Pigs have been extensively used as mediators of xenotransplantation research. Specifically, the Massachusetts General Hospital (MGH) miniature pig was developed to fix major histocompatibility antigens for use in xenotransplantation studies. We generated transgenic pigs for xenotransplantation using MGH pigs. However, it has not been studied yet whether these pigs show similarity of reproductive physiological characteristics to wild types of MGH miniature pig. In this study we analyzed the estrous cycles and pregnancy characteristics of wild type (WT) and transgenic MGH miniature pigs, which were ${\alpha}1,3$-galactosyltransferase (GalT) heterozygous and homozygous knock-out, and membrane cofactor protein (MCP) inserted in its locus, $GalT^{-MCP/+}$ and $GalT^{-MCP/-MCP}$ pigs. Estrous cycles of WT, $GalT^{-MCP/+}$ and $GalT^{-MCP/-MCP}$ pigs were $20.9{\pm}0.74$, $20.1{\pm}1.26$, and $17.3{\pm}0.87days$, respectively, and periods of estrous were $3.2{\pm}0.10$, $3.1{\pm}0.12$, and $3.1{\pm}0.11days$. The periods of gestation of WT, $GalT^{-MCP/+}$ and $GalT^{-MCP/-MCP}$ pigs were $114.2{\pm}0.37$, $113.3{\pm}0.67$, and $115.4{\pm}0.51days$, respectively. Litter sizes of WT, $GalT^{-MCP/+}$ and $GalT^{-MCP/-MCP}$ pigs were $4.8{\pm}0.35$, $4.8{\pm}1.11$ and $3.0{\pm}0.32$ respectively. There were no significant differences on estrous cycle, periods of estrous and gestation, and litter size among WT, $GalT^{-MCP/+}$ and $GalT^{-MCP/-MCP}$ pigs, meaning that GalT knock-out and additional expression MCP of the MGH miniature pig did not effect on reproduction traits. These results provide relevant information to establish breeding system for MGH transgenic pig, and for propagation of $GalT^{-MCP/-MCP}$ pig to supply for xenotransplantation research.
태반 영양배엽 (trophoblast)은 포유동물의 발생과정 중 가장 먼저 분화되는 세포로서, 자궁환경내에서 배아가 착상, 발생, 및 분화하기 위해서 반드시 필요한 태반을 형성하는 색심적인 세포이다. 영양배엽 세포의 분화과정중의 결함은 배아의 사산이나 임신질환 등의 치명적 결과를 초래한다. 하지만, 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 분자생물학적인 메카니즘은 아직 규명되지 않고 있다. 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 경로를 규경하기 위한 선결과제는 분화된 영양배엽 세포에서만 발현하는 많은 유전자들이 밝혀져야만 한다. 본 연구팀은 최근에 분화된 영양배엽 세포에서만 발현하는 두 종류의 새로운 유전자들을 찾았다. 한 종류는 homeobox를 보유하고 있는 조절 유전자 Psx이고, 다른 한 종류는 임신호르몬인 태반 프로락틴 라이크 단백질 유전자 PLP-C${\beta}$이다. 본 연구과제의 목표는 이들 유전자의 기능과 조절 메카니즘을 규명함으로써, 영양배엽 세포의 분화를 조절하는 조절경로를 밝히는 것이다. 이를 위하여 다음과 같은 일련의 연구를 수행할 것이다. 1) Psx 유전자가 분화된 영양배엽 세포에서만 발현케 하는 조절 메카니즘을 규명하기 위해 functional assays, in vitro footprinting, gel mobility shift assays, 생쥐형질전화, UV crosslinking, Southwestern blot 등의 방법을 통해 Psx 유전자의 cis-acting 요인과 trans-acting factor를 밝혀 분석한다. 2) 영양배엽 세포의 분화조절 경로를 규명하기 위해 random oligonuclotide library screening, DD-PCR, subtractive screening 등의 방법을 이용하여 Psx 유전자에 의해 조절되는 하부유전자를 밝힌다. 3) Psx 유전자를 knock-out시켜 영양배엽 세포가 발달 및 분화하는데 미치는 역할을 밝힌다. 4) Yeast two-hybrid screening방법을 이용하여 태반 프로락틴 유전자의 수용체를 찾아 이들의 신호전달 기전을 밝힌다. 제1차년 연구결과로서, mouse와 rat으로부터 각각 Psx 유전자의 genomic DNA를 클로닝하여, 유전자 구조를 비교한 결과, mouse Psx (mPsx2)는 4개의 exons으로 이루어져 있는 반면에, rat Psx (Psx3)는 3개의 exons으로 구성되어 있었다. 즉, rPsx3는 mPsx2의 exon1이 없었다. Notrhern blot과 in situ hybridization 분석에 의해 mouse와 rat에서 Psx 유전자가 다르게 발현 조절되는 현상을 밝혔다. 실제로 mPsx2와 rPsx3의 5'-flanking지역을 클로닝하여 염기서열 분석 결과 전혀 homology를 찾을 수 없었다. 또한, 이들 각각 promoter의 activity를 luciferase reporter를 이용하여 조사한 결과 Rcho-1 trophoblast cells에서 각기 다른 activity를 보여 주는 것을 발견하였다. Psx 유전자의 transcription start sites는 Primer extension에 의해 밝혔다. 또한 Psx2 유전자를 knock-out 시키기 위해 targeting vector를 Osdupde1에 제작하였다. 본 과제를 시작할 때 새로운 프로락틴 유전자 하나를 클로닝하여 이 유전자를 PLP-I라고 이름을 붙였다. 이 후 이 유전자 (PLP-I)는 PLP-C${\beta}$라고 이름을 붙이게 되었다. Mouse PLP-C${\beta}$ 유전자의 counterpart를 rat에서 찾아 염기서열을 비교한 결과 mouse와 rat에서 PLP-C${\beta}$유전자의 homology는 약 79% (amino acid level)였다. 본 연구과정을 통해 또 하나의 새로운 PLP-C subfamily member를 mouse로부터 클로닝 하였고, 이 유전자를 PLP-C${\gamma}$라 하였다. PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$의 발현 유형은 Northern blot과 in 냐셔 hybridization 분석에 의해 태반의 제한된 spongitrophoblast와 trophoblast giant cells에서만 발현하는 것을 밝혔다. 놀랍게도 이들 두 새로운 유전자는 alternative splicing에 의해 두 종류의 isoform이 있음을 밝혔다. PLP family member 유전자로서 splicing에 의한 isoforms을 보여 주는 유전자로는 PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$가 최초이다. 이들 isoform mRNAs의 발현 유형은 RT-PCR 방법을 이용하여 규명하였다. 또 하나의 새로운 발견은 PLP-C${\beta}$와 PLP-C${\gamma}$가 독특한 유전자 구조를 갖고 있었다. 즉, PLP-C${\beta}$는 exon3의 alternative splicing에 의해 5개 혹은 6개의 exons을 갖는 two isoforms이 생긴다. 반면에 PLP-C${\gamma}$는 exon2가 alternative splcing이 되면서 7개의 exons을 갖거나 6개의 exons을 갖는 isoforms을 만든다. 그리고, PLP-C${\gamma}$의 promoter activity를 trophoblast Rcho-l${\gamma}$ 세포주를 이용하여 PLP-C${\gamma}$ 의 1.5 kb 5'-flanking 지역이 trophoblast-specific promoter activity를 갖고 있음을 밝혔다. PLP-C${\gamma}$ 유전자의 transcription start site는 Primer extension에 의해 밝혔다. 제 1차 년도의 연구결과를 토대로, 2차년에서는 다음단계의 연구를 수행하고자 한다. 즉, 1) mPsx2와 rPsx3의 promoter를 비교분석 함으로서 mouse와 rat에서 Psx 유전자가 다르게 조절되는 메카니즘 규명, 2) Psx와 PLP-C 유전자의 promoter에 있는 cis-acting elements 탐색, 3) Psx2와 Psx3의 단백질을 이용하여 이들이 binding하는 target sequence 규명, 4) 제작한 Psx2 targeting vector를 이용하여 ES cells에서 Psx2 유전자 knock-out, 5) Psx 유전자를 과발현시키는 세포주를 만들고 Psx에 의해 조절되는 유전자 탐색, 6) 새로 밝히 PLP-C members 유전자들의 조절기전을 Rcho-1 세포주를 이용하여 여러 거지 성장인자와 다른 호르몬에 대한 반응을 탐색, 7) Psx와 PLP-C${\gamma}$ 유전자의 chromosomal mapping 등을 밝힐 것이다.
Acute vascular rejection has been known as a main barrier occurring in a xenograted tissue of alpha 1,3-galactosyltransferase knock-out (GalT KO) pig into a non-human primate (NHP). Adenosine which is a final metabolite following sequential hydrolysis of nucleotide by ecto-nucleotidases such as CD39 and CD73, act as a regulator of coagulation, and inflammation. Thus xenotransplantation of CD39 and CD73 expressing pig under the GalT KO background could lead to enhanced survival of recipient NHP. We constructed a human CD39 and CD73 expression cassette designed for endothelial cell-specific expression using porcine Icam2 promoter (pIcam2-hCD39/hCD73). We performed isolation of endothelial cells (pAEC) from aorta of 4 week-old GalT KO and membrane cofactor protein expressing pig ($GalT^{-MCP/-MCP}$). We were able to verify that isolated cells were endothelial-like cells using immunofluorescence staining analysis with von Willebrand factor antibody, which is well known as an endothelial maker, and tubal formation assay. To find optimal condition for efficient transfection into pAEC, we performed transfection with GFP expression vector using four programs of nucleofection, M-003, U-023, W-023 and Y-022. We were able find that the program W-023 was optimal for pAEC with regard to viability and transfection efficiency by flow cytometry and fluorescent microscopy analyses. Finally, we were able to obtain $GalT^{-MCP/-MCP}/CD39/CD73$ pAEC expressing CD39 and CD73 at levels of 33.3% and 26.8%, respectively. We suggested that pACE isolated from $GalT^{-MCP/-MCP}$ pig might be provided as a basic resource to understand biochemical and molecular mechanisms of the rejections and as an alternative donor cells to generate $GalT^{-MCP/-MCP}/CD39/CD73$ pig expressing CD39 and CD73 at endothelial cells.
일반적으로 구조물에 폭발, 충돌, 지진과 바람 등과 같이 짧은 시간에 큰 하중이 작용하게 되면 구조물은 국부적으로 재료의 대변형(large deformation), 대회전(large rotation), 대변형률(large strain)등이 발생하게 된다. 이와 같은 현상을 해석하려면 전산연속체 역학에 기초하여 유체-구조물 상호작용 등을 고려할 수 있는 하이드로코드(Hydrocode)의 도움이 필요하다. 또한, 폭발로 인해 발생되는 순간 동역학적인 폭발 메커니즘은 매우 복잡하기 때문에 폭발실험을 병행하여 거동을 예측하는 것이 합리적인 방법이지만 막대한 비용과 시설이 요구되므로 한계가 있는 것도 사실이다. 따라서 본 논문에서는 하이드로코드인 AUTODYN을 사용하여 폭발해석한 결과를 기수행된 철근콘크리트 슬래브의 폭발실험 결과와 비교하여 폭발해석 방법의 타당성을 검토하였고, 동일한 폭발해석 모형에 대하여 철근 배근간격, 피복두께의 변화 및 수직철근 유무에 따른 폭발 손상도를 비교검토하였다. 검토한 결과, 철근의 배근간격에 대한 철근콘크리트 슬래브 두께의 비가 커질수록, 지름이 큰 철근보다 지름이 작은 철근을 많이 사용할수록, 마지막으로 수직철근을 배근할수록 콘크리트 구조물의 내폭성능이 향상됨을 알 수 있었다.
Two distinct spider communities were studied in the crowns and ground surfaces of pine plantations at Mt. Ungilsan, Kyonggi-do using pitfall traps and knock-down by spraying of an insecticide (D.D.V.P.) to sample spiders. There were 34 species of 11 families in the ground community and 41 species of 15 families in the crown community, with only 9 species being collected in both. Wandering spiders comprised 78.5% of the crown community and 90.8% of the ground community. Guild abundance and the most abundant families were distinctly different in the two habitats: agile hunters (Salticidae:32.4%) and nocturnal hunters (Clubionidae:19%) in the crown, runners (Lycocidae:32.8%) and nocturnal hunters (Gnaphosidae:31.2%) in the ground. Dominant species were Clubiona jucunda (Karsch) and Mymarachne japonica (Karsch) in the crown, while in the ground they were Pardosa laura Karsch and Gnaphosa silvicola. Species diversity(H ) had peaks in May, July and November in the ground community, while in the crown community peaks were in June and September. The seasonal trends of species diversity (H ) were due mainly to differences in the number of species and the numbers of individuals collected at each sample date rather than to differences in equitability among species. Spier guilds and dominant species have different seasonal patterns based on the temporal differences in prey availability in the two communities and the reduction of temporal overlap.
In a homothallic filamentous fungus Aspergillus nidulans, sexual and asexual developments are largely affected by the genetic and environmental factors. To regulate the complex subsets of genes involved in the developmental processes accurately, tight regulations of transcription factors are required. The forkhead type transcription factors are the class of regulators that function in a broad spectrum of cellular and developmental processes in many species from yeast to human. Here, we identified the fkhA and fkhB genes that encode a conserved forkhead transcription factors. The fkhA deletion resulted in the complete loss of fruiting body formation under all conditions favoring sexual development, suggesting that the fkhA gene is required for sexual development in A. nidulans. Overexpression of fkhA resulted in enhanced formation of fruiting bodies under induction condition not only in the normal condition but also in the condition of presence of 0.6 M KCl, which strongly inhibits sexual development. To know the function of the fkhB gene, we also generated fkhB knock-out strain in A. nidulans. Deletion of fkhB resulted in abnormal conidiophore formation under standard conditions and delayed sexual development process, suggesting that the fkhB gene plays an important role in conidiophore morphogenesis Taken together, these results suggest that the fkhA gene is necessary and sufficient for regulating sexual development and the fkhB gene is a transcription factor related in asexual developmental process in A. nidulans.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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