• International Journal of Stem Cells
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• 제15권1호
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• pp.95-103
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• 2022

Background and Objectives: In recent years, brain organoid technologies have been the most innovative advance in neural differentiation research. In line with this, we optimized a method to establish cerebral organoids from feeder-free cultured human pluripotent stem cells. In this study, we focused on the consistent and robust production of cerebral organoids comprising neural progenitor cells and neurons. We propose an optimal protocol for cerebral organoid generation that is applicable to both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells. Methods and Results: We investigated formation of neuroepithelium, neural tube, and neural folding by observing the morphology of embryoid bodies at each stage during the cerebral organoid differentiation process. Furthermore, we characterized the cerebral organoids via immunocytochemical staining of sectioned organoid samples, which were prepared using a Cryostat and Vibratome. Finally, we established a routine method to generate early cerebral organoids comprising a cortical layer and a neural progenitor zone. Conclusions: We developed an optimized methodology for the generation of cerebral organoids using hESCs and hiPSCs. Using this protocol, consistent and efficient cerebral organoids could be obtained from hiPSCs as well as hESCs. Further, the morphology of brain organoids could be analyzed through 2D monitoring via immunostaining and tissue sectioning, or through 3D monitoring by whole tissue staining after clarification.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제12권3호
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• pp.221-229
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• 2008

줄기세포를 임상에 적용하기 위해서는 체외에서 증식 과정이 필수적이다. 그러나 배아줄기세포와는 달리 성체줄기세포는 체외에서 증식할 경우 일정시간이 지나면 줄기세포의 특성을 잃기 때문에 임상사용에 있어 제한점을 가지고 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 줄기세포의 특성을 잃지 않게 세포를 보존하는 방법이 필요하며, 본 연구에서는 탯줄 유래 줄기세포를 동결 보존한 후 해동시켜 줄기세포의 특성을 분석하였다. 사람의 탯줄 유래 세포를 분리하여 체외에서 배양한 후 2번째 또는 3번째 계대의 세포를 25% FBS와 10% DMSO가 첨가된 냉동배양액에 넣어 $-196^{\circ}C$에서 동결보존한 후, 6개월 뒤에 해동시켜 세포의 성장 속도와 유전자 및 단백질 발현을 살펴보았다. 냉동 보존한 후 세포를 해동시킨 결과 74%의 생존율을 보였으며, 이 세포를 체외에서 배양하였을 경우, 냉동보존하기 전의 세포와 유사하게 방추사 모양의 섬유 아세포의 형태를 나타냈다. 또한, 성장 속도 역시 냉동보존하기 전의 세포와 똑같이 10번째 계대까지 배양되었으며, 42번 분열 능력을 나타냈다. RT-PCR 결과, 냉동 전후 세포 모두에서 Oct-4, nanog, SCF, NCAM, nestin, GATA4, BMP4, HLA-1 유전자는 모두 발현하였으며, Brachyury와 HLA-DR은 발현하지 않았다. 면역세포 화학 염색 결과, 배아줄기세포 단백질로 알려진 SSEA-3, -4, Oct-4 그리고 중간엽줄기세포 단백질인 Thy-1은 모두 발현하였으며, vimentin, fibronectin, HLA-1, HCAM, ICAM 모두 발현하였다. 그러나 SSEA-4과 Thy-1, vimentin, fibronectin, HLA-1는 냉동보존한 후 배양된 탯줄질의 발현은 냉동보존하기 전후의 탯줄 유래 세포에서 큰 차이가 없었다. 냉동 보존된 탯줄 유래 세포는 세포의 분열능력과 유전자 및 단백질의 발현이 냉동 보존 전 세포와 유사한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 냉동보존법이 임상적으로 세포 치료 시 적절한 세포의 수나 시간을 맞추는데 효과적인 방법이 될 수 있을 것으로 기대된다.

• Applied Microscopy
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• 제24권4호
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• pp.61-77
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• 1994

The calcium-binding proteins (CaBP), parvalbumin (PV) and calbindin-D 28K (calbindin) are particularly abundant and specific in their distribution, and present in different subsets of neurons in many brain regions. Although their physiological roles in the neurons have not been elucidated, they are valuable markers of neuronal subpopulations for anatomical and developmental studies. This study is designed to characterize dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) neurons and axon terminals in terms of differential expression of immunoreactivity (IR) for two well-known CaBPs, PV and calbindin. The experiments were carried out on 6 adult monkeys. Monkeys were perfused under deep Nembutal anesthesia with 2% paraformaldehyde and 0.2% glutaraldehyde in 0.1M phosphate buffer. After removal, the brains were postfixed for 6-8 hr in 2% paraformaldehyde at $4^{\circ}C$ and infiltrated with 30% sucrose at $4^{\circ}C$. Thereafter, they were frozen in dry ice. Serial sections of the thalamus, at $20{\mu}m$, were made in the frontal plane with a sliding microtome. The sections were stained for PV and calbindin with indirect immunocytochemical methods. For electron microscopy, after infiltration with 30% sucrose the blocks of thalamus were serially sectioned at $50{\mu}m$ with a Vibratome in the coronal plane and stained immediately by indirect ABC methods without Triton X-100 in incubation medium. Stained sections were postfixed in 0.2% osmium tetroxide, dehydrated and flat-embedded in Spurr resin. The block was then trimmed to contain only a selected lamina or interlaminar space. The dLGN proper showed strong PV IR in fibers in all laminae and interlaminar zones. Particularly dense staining was noted in layers 1 and 2 that contain many stained fibers from optic tract. Neuronal cell body stained with PV was concentrated only in the laminae. In these laminae staining was moderate in cell bodies of all large and medium-sized neurons, and was strong in cell bodies of some small neurons together with their processes. Calbindin IR was marked in the neuronal cell body and neuropil in the S layers and interlaminar zones whereas moderate in the neuropil throughout the nucleus. Regional difference in distribution of PV and calbindin IR cell is distinct; the former is only in the laminae and the latter in both the S layer and interlaminar space. The CaBP-IR elements were confined to about $10{\mu}m$ in depth of Vibratome section. The IR product for CaBP was mainly associated with synaptic vesicle, pre- and post-synaptic membrane, and outer mitochondrial membrane and along microtubule. PV-IR was noted in various neuronal elements such as neuronal soma, dendrite, RLP, F, PSD and some myelinated or unmyelinated axons, and was not seen in the RSD and glial cells. Only a few neuronal components in dLGN was IR for calbindin and its reaction product was less dense than that of PV, and scattered throughout cytoplasm of soma of some relay neurons, and was also persent in some dendrite, myelinated axons and RLP. The RSD, F, PSD and glial elements were always non-IR for calbindin. Calbindin labelled RLP were presynaptic to unlabeled dendrite or dendritic spine and PSD. Calbindin-labeled dendrite of various sizes were always postsynaptic to unlabeled RSD, RLP or F. From this study it is suggested that dLGN cells of different functional systems and their differential projection to the visual cortex can be distinguished by differential expression of PV and calbindin.

• Radiation Oncology Journal
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• 제12권1호
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• pp.27-31
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• 1994

종양의 조직학적 형태에 따라 또 같은 조직의 종양에서도 각 환자에 따라 방사선 치료에 대한 반응 정도에는 많은 차이가 관찰된다. 이러한 방사선 감수성을 예측하는 한 방법으로 각 환자에서 떼어낸 종양조직을 일차 배양하여 방사선 조사에 의한 세포 생존 곡선을 구한뒤 2Gy에서의 생존(SF2)을 얻었다. 방사선 치료가 계획된 두경부 종양과 자궁경부암 환자의 종양 조직을 얻어 기계적인 방법으로 미세절편으로 만든 후 collagenase type IV와 2시간 배양하여 단일 종양세포 혼탁액을 얻었다. Cell adhesive matix로 전처리된 24 well plate에 각 well당 일정수의 세포를 넣어 24시간 배양한뒤 각 열에 0, 1, 2, 3, 4. 6Gy의 방사선을 조사하였다. 13일간 배양후 crystal violet으로 염색한뒤 image analysis system을 이용하여 각 well의 광학밀도를 측정하여 세포 생존을 구한다. Linear quadratic model에 의한 생존 곡선을 얻은 뒤 2Gy에서의 생존율을 구하였다. 배양된 세포가 편평상 피암세포임을 확인하기 위하여 cytokeratin과 epithelial monoclonal 항체를 이용한 Immunocytochemical 염색을 하여 형광 현미경으로 관찰하였다. 5명의 두경부종양 환자와 20명의 자궁경부암 환자의 종양조직을 얻어 실험하여 15명(60$ \% $) 종양의 2Gy 생존을 얻는데 성공하였다. 10명의 일차 배양 실패의 원인은 단일 종양세포 혼탁액에 종양세포가 너무 적었거나 세포 이식후 배양이 잘 자라지 않은 것으로 판정되었다. 15편평 상피암 세포의 SF2의 평균은 0.55$\pm$0.17이었으며 범위는 0.20에서 0.79까지로 같은 편평상피암이라도 각 환자에 따라 SF2 간에 큰 차이를 보이는 것을 알 수 있었다. 이상에서 같은 부위에 생긴 같은 조직 유형의 종양이라도 각 환자마다 SF2 값의 차이가 큰 것으로 보아 방사선 치료의 효과를 예측할 수 있는 한 인자로 SF2 값을 이용할 수 있을 것으로 생각된다.

• Applied Microscopy
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• 제29권3호
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• pp.383-403
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• 1999

흰쥐 성체 전뇌 기저부의 수직 및 수평 대각 Broca대에서 각 형별 ChAT 면역반응 신경세포의 조직학적 및 미세구조적 특징을 면역조직화학 및 전자현미경을 이용한 면역세포화학적 방법으로 조사하였다. ChAT 면역반응 신경세포에서 광학현미경적 면역반응은 세포체의 세포질과 신경돌기에서 확인되었다. 아울러 미세구조적 관찰로 ChAT 면역반응은 핵외막, 조면소포체의 막, 자유리보좀 그리고 polysomes에서 나타났다. 수직 및 수평 대각 Broca대에서 ChAT 면역반응 신경세포는 세포의 모양과 세포체의 장 단축의 비에 따라 원형, 난형, 세장형, 방추형, 삼각형 그리고 다각형으로 분류되었다. 이 각각의 세포형들을 전자현미경을 이용하여 미세구조적으로 관찰한 결과, 세포체의 크기, 세포질에 대한 핵의 상대적 크기, 세포소기관의 종류 및 분포양상, 신경연접의 수 및 종류 등의 기준에 따라 면역반응 신경세포들은 아유형 I, II로 분류되었다. 그러나, 방추형 및 삼각형 면역반응 신경세포에서는 아유형 I만이 관찰되었다. 아유형 I 면역반응 신경세포는 핵막함입을 보이는 작은 핵과 풍부한 세포질을 포함하였다. 이들 면역반응 세포질은 평행한 긴 수조들로 규칙적인 층판을 이룬 잘 발달된 rER를 함유하였다. 1, 2개의 층판체와 nematosome들이 세포질에서 관찰되었다. 축삭-세포체 신경연접은 주로 대칭형이었으며, 축삭-수상돌기 신경연접은 대다수 비대칭형이었다. 아유형 II 면역반응 신경세포는 비교적 깊은 핵막함입을 보이는 큰 핵과 빈약한 세포질을 포함하였다. rER는 발달이 미약하였다. 축삭-세포체 신경연접은 대칭형과 비대칭형이 같은 비율로 나타났고, 축삭-수상 돌기 신경 연접은 주로 비대칭형이었다. 이상과 같은 미세구조적 관찰에서 ChAT 면역반응 신경세포가 방추형과 삼각형을 제외한 모든 세포형에서 아유형 I, II로 분류되는 것은 투사영역의 원근에 의한 세포 대사활성의 차이에 기인한 것으로 생각된다.

• 한국동물학회지
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• 제31권2호
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• pp.111-121
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• 1988

고슴도치의(Erinaceus koneanus)췌강 각 부위별에 출현하는 glucagon(A)세포,insulin(B)세포, somatostatin(D)세포 및 pancreatic polypeptide(PP)세포 등 4종의 내분비세포의 출현빈도, 분포상태, 모양 및 크기 등을 관찰하고자 췌장을 비장부와 십이지장부로 구분하고 이를 각각 근위부, 중간부 및 원위부로 세분한 후 면역세포화학적 방법을 시도하여 광학현미경하에서 검경하였던 바 다음과 같은 결론을 얻었다. Glucagon(A)세포의 크기는13 $\mu$ m x 9.5 $\mu$ m였고 그 모양은 원형, 난원형 및 추체형을 띠고 있었으며 췌도의 주변부와 외분비 실질사이에 분포하고 있었다. A세의 출현빈도는 비장부의 모든 부의에서 24.5%-30.5%, 십이지장부의 원위부에서 30.1%로 관찰되었으나 십이지장부의 근위부와 중간부에서는 2.6%-5.2%로 관찰되었다. Insulin(B)세포의 크기는 11.6$\mu$m x 9.4$\mu$m로서 원형 또는 난원형을 띠었고 췌도내에 균등하게 분포하고 있었으며, 비장부의 모든 부위와 십이지장의 원위부에서는 63.5%-68.9%, 십이지장부의 근위부와 중간부에서는 35.9%-55.6%로 출현하였다. Somatostatin(D)세포는 크기가 12.6$\mu$m x 9.1 $\mu$m로서 주변부와 외분비 실질사에 나타났으며 세포의 출현빈도는 비장부와 십이장부의 모든 부위에서 2.6%-5.9%로서 소수 관찰되었다. Pancreatic polypeptide(PP)세포는 크기가 12.8$\mu$ m x 8.5 $\mu$m였고 세포의 모양은 원형, 난원형 및 추체형 등 다양하였으며 췌도의 주변부와 외분비실질간에 주로 분포하고 있었다. PP세포의 출편빈도는 십이지장부의 근위부와 중간부에서는 각각 42.5%, 55.4%로서 관찰된 반면 비장부의 모든 부위와 십이지장부의 원위부에서는 0.5%-2%로서 소수 출현되었다.

• 생명과학회지
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• 제15권2호
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• pp.253-260
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• 2005

인체 MCAK 단백질을 Escherichia. coli에서 재조합 단백질로 발현하였다. 이를 SDS-PAGE 후 electroelution으로 정제하고 항원으로 사용하여 rat에서 다클론성 항체생성을 유도한 결과, 생성된 항체는 Western blot analysis에 의해 인체 MCAK 단백질 (81 kDa)을 특이적으로 인식할 수 있었으며, Jurkat T cells과 293T cells에 있어서 MCAK 단백질의 대부분이 핵 내에 위치함을 확인할 수 있었다. 세포주기에 따른 MCAK 단백질의 발현양의 변화를 조사하기 위해, Jurkat T cells을 Hydroxy urea 또는 Nocodazole의 처리로 $G_{1}/S$ boundary 그리고 $G_{2}/M$ boundary에 blocking하고 이로부터 release 시키는 시간을 달리하여 다양한 세포주기상에 위치한 Jurkat T cells을 확보하였다. 각각의 Jurkat T cells로부터 cell lysate를 얻어서 Western blot analysis를 시도한 결과, MCAK 발현양은 S phase에서 가장 높았으며 MCAK의 SDS-PAGE상의 mobility가 81 kDa에서 84 kDa로 shift됨을 확인하였다. MCAK의 전기영동상의 mobility shift에 의한 slow moving $p84^{HsMCAK}$는 S phase 후반부터 나타나기 시작하며 $G_{2}/M$ phase에 최대였고 $G_{1}$, phase에서는 확인되지 않았다. 이는 세포주기에 따라 MCAK의 단백질의 인산화 양상이 달라짐을 시사한다. 생성된 항체를 이용한 Immunocytochemical analysis의 결과, 인체 MCAK 단백질은 세포주기의 interphase에서는 주로 중심체와 핵에 존재하며, M phase의 각 단계에 따라서 spindle pole, centromere, spindle fiber 또는 midbody에 존재함을 확인하였다. 이러한 연구 결과는 E. coli에서 발현된 재조합 HsMCAK 단백질을 항원으로 하여 rat에서 생산한 다클론성 항체가 HsMCAK 단백질을 특이적으로 인식할 수 있음과 또한 HsMCAK 단백질의 인산화를 나타내는 SDS-PAGE상의 mobility-shift가 $G_{2}/M$ phase에 최대에 도달하는 양상으로 세포주기에 따라 변동됨을 나타내며, HsMCAK의 인산화와 HsMCAK의 세포 내 위치간의 관련성을 시사한다. 아울러 이러한 연구결과는 hamster 및 Xenopus 등에서 주로 연구되고 있는 MCAK의 세포주기상의 주요기능이 인체세포에도 적용될 수 있음을 시사한다.

• Journal of Periodontal and Implant Science
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• 제49권5호
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• pp.270-286
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• 2019

Purpose: Despite the well-known anti-inflammatory effects of vitamin D in periodontal health, its mechanism has not been fully elucidated. In the present study, the effect of vitamin D on strengthening E-cadherin junctions (ECJs) was explored in human gingival keratinocytes (HGKs). ECJs are the major type of intercellular junction within the junctional epithelium, where loose intercellular junctions develop and microbial invasion primarily occurs. Methods: HOK-16B cells, an immortalized normal human gingival cell line, were used for the study. To mimic the inflammatory environment, cells were treated with tumor necrosis factor-alpha ($TNF-{\alpha}$). Matrix metalloproteinases (MMPs) in the culture medium were assessed by an MMP antibody microarray and gelatin zymography. The expression of various molecules was investigated using western blotting. The extent of ECJ development was evaluated by comparing the average relative extent of the ECJs around the periphery of each cell after immunocytochemical E-cadherin staining. Vitamin D receptor (VDR) expression was examined via immunohistochemical analysis. Results: $TNF-{\alpha}$ downregulated the development of the ECJs of the HGKs. Dissociation of the ECJs by $TNF-{\alpha}$ was accompanied by the upregulation of MMP-9 production and suppressed by a specific MMP-9 inhibitor, Bay 11-7082. Exogenous MMP-9 decreased the development of ECJs. Vitamin D reduced the production of MMP-9 and attenuated the breakdown of ECJs in the HGKs treated with $TNF-{\alpha}$. In addition, vitamin D downregulated $TNF-{\alpha}$-induced nuclear factor kappa B ($NF-{\kappa}B$) signaling in the HGKs. VDR was expressed in the gingival epithelium, including the junctional epithelium. Conclusions: These results suggest that vitamin D may avert $TNF-{\alpha}$-induced downregulation of the development of ECJs in HGKs by decreasing the production of MMP-9, which was upregulated by $TNF-{\alpha}$. Vitamin D may reinforce ECJs by downregulating $NF-{\kappa}B$ signaling, which is upregulated by $TNF-{\alpha}$. Strengthening the epithelial barrier may be a way for vitamin D to protect the periodontium from bacterial invasion.

• Archives of Plastic Surgery
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• 제34권6호
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• pp.679-684
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• 2007

Purpose: DMH(1,2-dimethylhydrazine) has been known to induce vascular neoplasm such as malignant endothelioma in animal experiment, through induction of abnormal proliferation of HUVECs. In our previous studies, 11 types of PKC isoenzymes were determined by RT-PCR and the expression of $PKC{\alpha}$, and ${\mu}$ was more prominent than other PKC isoenzymes in the DMH-treated group. However, this result was not based on objective assessment. In this study, we further evaluated the role of $PKC{\alpha}$ on the DMH-induced abnormal proliferation of HUVECs by two different methods to identify its presence with high relevance in objective view. $PKC{\mu}$ will be investigated in further study. Methods: The study was conducted with the cultured HUVECs group(control) and the $0.75{\times}10^{-9}M$ DMH-treated group. After processing protein extraction in 0 and 24 hour, extracted protein was treated of quantitative test through BCA protein assay. In the western blot analysis, electrophoresis was performed in the order of gel preparation, sample preparation, and gel running. Electrotransfer to nitrocellulose membrane and reaction with antibody were done. Detection of $PKC{\alpha}$ was achieved through "Gel Image Analysis System". In the fluorescence immunocytochemical analysis, the grading of radiance of the intracellular $PKC{\alpha}$ particles was detected with confocal microscope after treating with primary and fluorescent secondary antibody in 0 and 24 hours. Results: The Western blot analysis showed increased $PKC{\alpha}$ expression from the specimen obtained in 24 hour of the DMH treatment group when compared to those in control group. Under confocal fluorescence microscope, the emitting radiance in the DMH treated group was brighter at 24 hours as well. Conclusion: We believe that $PKC{\alpha}$ plays a role in DMH-induced abnormal proliferation of the vascular endothelium, which may provide insights in understanding the vascular neoplasm.

• 대한예방한의학회지
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• 제3권1호
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• pp.1-33
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• 1999

In order to compare and study the effects of Kamipalmijiwhang tang(加味八味地黃湯) & Kamigangwhalsokdantang(加味羌活續斷湯) on inhibition of osteoporosis induced by ovariectomy, the author administered Kamipalmijiwhangtang & Kamigangwhalsokdantang to the sample groups per orally before and after ovariectomy. The author observed the activities of cathepsin L, K and the contents of calcium, calcitonin, osteocalcin and phosphorus in the serum for the biochemical index, the contents of IL-6 in the serum and bone marrow for immunological index, the state of bone loss in the metaphysis of tibia by histological study, the expression of ELAM-1 &collagen IV by immunohistochemical analysis, the expression of fos by immunocytochemical analysis. The results were as follows: 1. The activities of cathepsin L, K in the serum had a significant inhibitive effects in all sample groups compared with the control group. The inhibitive effects of Sample A-1 & B-1 was better than those of A-2 & B-2 and the inhibitive effects of sample B-1 & B-2 was better than those of A-1 & A-2. 2. The content changes of IL-6 in the serum and bone marrow had a significant inhibitive effects in all sample groups compared with the control group. The inhibitive effects of sample A-1 & B-1 was better than those of A-2 & B-2 and the inhibitive effects of sample B-1 & B-2 was better than those of A-1 & A-2. 3. In the histological study of tibial metaphysis all the sample groups inhibited bone loss significantly compared with the control group and expressed trabecula shape of bone similar to the normal group. 4. The expression of ELAM-1 & collagen IV decreased a little bit in sample A-2. It also decreased to a similar degree in sample B-2 like normal group and disturbed itself. 5. The expression of fos was inhibited in all sample groups compared with control group. The inhibitive expression of sample B-1 & B-2 was more remarkable than those of A-1. & A-2. 6. The serum calcium had a significant increasing effects in an sample groups compared with control group. Each sample groups didn't have any significant difference. 7. The serum calcitonin had a significant increasing effects in sample A-1, A-2 and B-1 groups compared with control group. Each sample groups didn't have any significant difference. 8. The serum osteocalcin and phosphorus didn't have any significant difference in all sample groups compared with control group.