Spherical micro silica sol-gel immobilized enzyme beads were prepared in an emulsion system using cyclohexanone and Triton-X 114. The beads were used for the in situ immobilization of transaminase, trypsin, and lipase. Immobilization during the sol to gel phase transition was investigated to determine the effect of the emulsifying solvents, surfactants, and mixing process on the formation of spherical micro sol-gel enzyme beads and their catalytic activity. The different combinations of sol-gel precursors affected both activity and the stability of the enzymes, which suggests that each enzyme has a unique preference for the silica gel matrix dependent upon the characteristics of the precursors. The resulting enzyme-entrapped micronsized beads were characterized and utilized for several enzyme reaction cycles. These results indicated improved stability compared to the conventional crushed form silica sol-gel immobilized enzyme systems.
The lipase from Mucor racemosus NRRL 3631 was partially purified by fractional precipitation using 60% ammonium sulfate, which resulted in a 8.33-fold purification. The partially purified lipase was then immobilized using different immobilization techniques: physical adsorption, ionic binding, and entrapment. Entrapment in a 4% agar proved to be the most suitable technique (82% yield), as the immobilized lipase was more stable at acidic and alkaline pHs than the free enzyme, plus 100% of the original activity was retained owing to the thermal stability of the immobilized enzyme after heat treatment for 60 min at $45^{\circ}C$. The calculated half-lives (472.5, 433.12, and 268.5 min at 50, 55, and $60^{\circ}C$, respectively) and the activation energy (9.85 kcal/mol) for the immobilized enzyme were higher than those for the free enzyme. Under the selected conditions, the immobilized enzyme had a higher $K_m$ (11.11 mM) and lower $V_{max}$ (105.26 U/mg protein) when compared with the free enzyme (8.33 mM and 125.0 U/mg protein, respectively). The operational stability of the biocatalyst was tested for both the hydrolysis of triglycerides and esterification of fatty acids with glycerol. After 4 cycles, the immobilized lipase retained approximately 50% and 80% of its original activity in the hydrolysis and esterification reactions, respectively.
Glutaraldehyde was used as a cross-linking agent for immobilization of purified ${\alpha}$-amylase from Exiguobacterium sp. DAU5. Befitting concentration of glutaradehyde and cross-linking time is the key to preparation of cross-linking chitosan beads. Based on optimized immobilization condition for ${\alpha}$-amylase, an overall yield of 56% with specific activity of 2,240 U/g on chitosan beads and 58% with specific activity of 2,320 U/g on chitosan-carbon beads was obtained. The optimal temperature and pH of each immobilized enzyme activity were $50^{\circ}C$ and 50 mM glycine-NaOH buffer pH 8.5, respectively. Those retained more than 75 and 90% of its maximal enzyme activity at pH 7.0-9.5 and after incubation at $50^{\circ}C$ for 1 h, respectively. In addition, the immobilization product showed higher organic-solvent tolerance than free enzymes. The mode of hydrolyzing soluble starch revealed that the ${\alpha}$-amylase possessed high hydrolyzing activity. These results indicate that chitosan is good support and has broad application prospects of enzyme immobilization.
Lee Ki Hoon;Kang Gyung Don;Shin Bong Seob;Park Young Hwan
Fibers and Polymers
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제6권1호
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pp.1-5
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2005
In this study, we attempted to evaluate a novel use of sericin-fixed silk fiber (SFx) as an immobilization support of enzyme. Sericin was fixed on the silk fiber using glutaraldehyde as a fixation reagent. After 6 hours of fixation, the degree of fixation increases linearly with linear decrease of the amount of bound $\alpha$-chymotrypsin (CT). This suggests that the increase of the degree of fixation is due to the further crosslinking of free aldehyde groups on the surface of sericin-fixed silk fiber (SFx). Even though perfect fixation was not achieved, sericin did not dissolve seriously and could be removed by further washing. The specific activity did not differ significantly after 6 hours of fixation. The activity of immobilized CT on SFx decreased to its half after 6 hours of incubation at 50$^{\circ}C$. However, it retained $78\%$ of initial activity even after 1 hour of treatment with $100\%$ ethanol. As a result, the SFx could be used as an immobilization support of enzyme in non-aqueous media at ambient temperature.
Zol, Muhamad Najmi Bin;Shuhaimi, Muhammad Firdaus Bin;Yu, Jimin;Lim, Yejee;Choe, Jae Wan;Bae, Sungjun;Kim, Han S.
Membrane and Water Treatment
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제11권3호
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pp.195-200
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2020
In this study, a biocatalyst composite was prepared by immobilizing oxidoreductases onto Cu-activated zeolite to facilitate biochemical decomposition of 4-chlorophenol (4-CP). 4-CP monooxygenase (CphC-I) was cloned from a 4-CP degrading bacterium, Pseudarthrobacter chlorophenolicus A6, and then overexpressed and purified. Type X zeolite was synthesized from non-magnetic coal fly ash using acetic acid treatment, and its surfaces were coated with copper ions via impregnation (Cu-zeolite). Then, the recombinant oxidative and reductive enzymes were immobilized onto Cu-zeolite. The enzymes were effectively immobilized onto the Cu-zeolite (79% of immobilization yield). The retained catalytic activity of CphC-I after immobilization was 0.3423 U/g-Cu-zeolite, which was 63.3% of the value of free enzymes. The results of this study suggest that copper can be used as an effective enzyme immobilization binder because it provides favorable metalhistidine binding between the enzyme and Cu-zeolite.
Laccase activity is influenced by copper (Cu) as an inducer. In this study, laccase was immobilized on Cu and Cu-magnetic (Cu/Fe2O4) nanoparticles (NPs) to improve enzyme stability and potential applications. The Cu/Fe2O4 NPs functionally activated by 3-aminopropyltriethoxysilane and glutaraldehyde exhibited an immobilization yield and relative activity (RA) of 93.1 and 140%, respectively. Under optimized conditions, Cu/Fe2O4 NPs showed high loading of laccase up to 285 mg/g of support and maximum RA of 140% at a pH 5.0 after 24 h of incubation (4℃). Immobilized laccase, as Cu/Fe2O4-laccase, had a higher optimum pH (4.0) and temperature (45℃) than those of a free enzyme. The pH and temperature profiles were significantly improved through immobilization. Cu/Fe2O4-laccase exhibited 25-fold higher thermal stability at 65℃ and retained residual activity of 91.8% after 10 cycles of reuse. The degradation of bisphenols was 3.9-fold higher with Cu/Fe2O4-laccase than that with the free enzyme. To the best of our knowledge, Rhus vernicifera laccase immobilization on Cu or Cu/Fe2O4 NPs has not yet been reported. This investigation revealed that laccase immobilization on Cu/Fe2O4 NPs is desirable for efficient enzyme loading and high relative activity, with remarkable bisphenol A degradation potential.
융합단백질의 절단을 위해 EK를 고정화하여 액상 절단반응과 같은 80%의 절단수율을 얻을 수 있었다. 그리고 니켈 친화칼럼을 이용하여 간단한 정제공정을 구축하였다. 공유결합한 EK의 경우 니켈친화 결합한 EK보다 높은 재접힘 수율을 나타내었고 풀림과 재접힘을 이용하여 효소의 초기 활성을 회복함에 따라서 반복사용을 통한 경제적인 절단공정을 구축할 수 있게 되었다. 그러나 고정화 과정에서 효소의 활성이 감소하는 문제점과 고정화 수율을 높이기 위한 연구가 필요하다.
In order to reuse enzyme efficiently, a mthod for ionic binding of fructosyltransferase to a porous carrier bearing quaternary alkyl alkanolammonium groups was investigated. The fructosyltransferase activity of the immobilized enzyme increased with increasing amount of loaded enzyme, and maximally reached 770U/g of the carrier when loaded amount of the enzyme was 18.2 mg/g carrier. The immobilized fructosyltransferase had optimum pH and temperature of 7.5 and 45$^{\circ}C$, respectively, whereas soluble enzyme had 6.5 and 55$^{\circ}C$: the Km value for the immobilized enzyme was 27.8 mM for sucrose, which was the same as that of soluble enzyme. In a batch reactor, the enzyme produced a mixture of fructooligosaccharides, mainly F$_2$G, from sucrose with the slight loss of enzyme activity during continuous operation of 12 days at 42$^{\circ}C$.
Tannase (Tan410) from a soil metagenomic library was immobilized on different supports, including mesoporous silica SBA-15, chitosan, calcium alginate, and amberlite IRC 50. Entrapment in calcium alginate beads was comparatively found to be the best method and was further characterized. The optimum pH of the immobilized Tan410 was shifted toward neutrality compared with the free enzyme (from pH 6.4 to pH 7.0). The optimum temperature was determined to be $45^{\circ}C$ for the immobilized enzyme and $30^{\circ}C$ for the free enzyme, respectively. The immobilized enzyme had no loss of activity after 10 cycles, and retained more than 90% of its original activity after storage for 30 days. After immobilization, the enzyme activity was only slightly affected by $Hg^{2+}$, which completely inhibited the activity of the free enzyme. The immobilized tannase was used to remove 80% of tannins from a green tea infusion on the first treatment. The beads were used for six successive runs resulting in overall hydrolysis of 56% of the tannins.
Optimal conditions for the in situ immobilization of lipase in aldehyde-silica packed columns, via reductive amination, were investigated. A reactant mixture, containing lipase and sodium borohydride (NaCBH), was recirculated through an aldehyde-silica packed column, such that the covalent bonding of the lipase, via amination between the amine group of the enzyme and the aldehyde terminal of the silica, and the reduction of the resulting imine group by NaCBH, could occur inside the bed, in situ. Mobile phase conditions in the ranges of pH $7.0{\~}7.8$, temperatures between $22{\~}28^{circ}C$ and flow rates from $0.8{\~}1.5\;BV/min$ were found to be optimal for the in situ immobilization, which routinely resulted in an immobilization of more than 70 mglipase/g-silica. Also, the optimal ratio and concentration for feed reactants in the in situ immobilization: mass ratio [NaCBH]/[lipase] of 0.3, at NaCBH and lipase concentrations of 0.75 and 2.5 g/L, respectively, were found to display the best immobilization characteristics for concentrations of up to 80 mg-lipase/g-silica, which was more than a 2-fold increase in immobilization compared to that obtained by batch immobilization. For tributyrin hydrolysis, the in situ immobilized lipase displayed lower activity per unit mass of enzyme than the batch-immobilized or free lipase, while allowing more than a $45\%$ increase in lipase activity per unit mass of silica compared to batch immobilization, because the quantity of the immobilization on silica was augmented by the in situ immobilization methodology used in this study.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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