• 생명과학회지
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• 제27권8호
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• pp.864-872
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• 2017

eCG는 다른 포유동물에서 FSH와 LH의 활성을 나타내기 때문에 성선자극 호르몬 family에서 아주 특이적이고 많은 당쇄가 수식되어진 알파와 베타의 비공유결합으로 구성되어 있다. 유전자 재조합 $eCG{\beta}/{\alpha}$의 생물학적 기능을 규명하기 위하여 말의 LH/CGR의 포유동물발현용 벡터를 구축하였다. 재조합 $eCG{\beta}/{\alpha}$의 활성분석은 말의 LH/CGR가 일시적으로 발현되는 CHO-K1 세포와 지속적으로 발현되는 PathHunter Parental 세포를 이용하여 분석하였다. 유전자 재조합 $eCG{\beta}/{\alpha}$는 CHO-K1 부유세포의 상층으로 효율적으로 분비되었으며, 분비량은 transfection 후 1일에서 7일까지 약 200 mIU/ml이었다. Western blot 분석결과는 재조합 $eCG{\beta}/{\alpha}$의 분자량은 약 40-45 kDa으로 검출되었다. eLH/CGR가 발현되는 CHO-K1 세포에서의 cAMP분비량으로 재조합 $eCG{\beta}/{\alpha}$의 활성을 분석하였다. 그 결과 cAMP농도는 재조합 $eCG{\beta}/{\alpha}$의 농도의존적으로 증가하였다. eLH/CGR가 일시적으로 발현하는 CHO-K1 세포에서 $EC_{50}$ 값은 $8.1{\pm}6.5ng$이었다. 또한 일시적 및 지속적으로 eLH/CGR가 발현하는 PathHunter Parental 세포에서도 재조합 $eCG{\beta}/{\alpha}$의 LH 활성 분석결과 높은 활성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 이들의 $EC_{50}$ 값은 각각 $5.0{\pm}4.7ng/ml$, $4.5{\pm}5.2ng/ml$으로 나타났다. 따라서 이러한 결과에 의하면 재조합 $eCG{\beta}/{\alpha}$는 말의 LH/CGR가 발현하는 세포에서 생물학적 활성을 나타난다는 것을 확인하였으며, PathHunter Parental 세포에서 지속적으로 발현되는 세포의 확보는 당쇄제거에 의한 재조합 eCG의 돌연변이등에 관한 기능적인 메커니즘을 밝히는데 유용할 것으로 사료된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제12권1호
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• pp.97-105
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• 2008

Vinclozolin (VCZ)은 침투성 살균제로써 과일, 채소, 와인산업에 널리 사용된다. VCZ와 그것의 대사산물들인 butenoic acid (M1)과 enanilide (M2)는 안드로겐 수용체를 놓고 항 안드로겐 물질로 작용한다. VCZ가 수컷의 생식생리와 병리에서 내분비계 장애물질(endocrine disrupting chemical, EDC)로 작용함에 대한 증거는 많이 있지만, 암컷 생식생리에 미치는 VCZ의 효과에 대한 증거는 전무하다. 본 연구자들은 이전 연구에서 VCZ가 미성숙 암컷 흰쥐의 사춘기 개시를 유의하게 지연시킴을 보고한 바 있는데, 이는 VCZ에 의해 시상하부-뇌하수체-난소(hypothalamus-pituitary-ovary, H-P-O) 생식 호르몬 축의 활성이 지연되거나 약화됨을 시사한다. 본 연구에서는 미성숙 암컷 흰쥐들의 VCZ 투여가 암컷 흰쥐의 시상하부-뇌하수체 축의 생식 호르몬 관련 유전자들 활성에 미치는 영향을 조사하였다. VCZ (10 mg/kg/day)를 생후 21일부터 첫 번째 질구개방이 관찰되는 날까지 매일 복강주사하였다. 시상하부와 뇌하수체의 표적 유전자들의 전사적인 변화량을 측정하기 위하여, total RNA를 추출하였고 반 정량적 역전사 중합효소반응(RT-PCR)을 실시하였다. VCZ 투여군에서 시상하부의 gonadotropin-releasing hormone (GnRH)의 분비를 조절함이 알려진 nitric oxide synthase-2 (NOS-2)의 전사활성은 대조군보다 유의하게 감소하였다(p<0.01). 유사하게, VCZ 투여군의 시상하부에서의 KiSS-1, G protein-coupled receptor54 (GPR54) 그리고 GnRH mRNA 수준도 감소하였다(p<0.01). 예상대로, VCZ 투여군의 뇌하수체 luteinizing hormone-${\beta}$ (LH-${\beta}$)과 follicle stimulating hormone-${\beta}$ (FSH-${\beta}$) 전사활성도 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다(p<0.01). 이번 연구를 통해 미성숙 암컷 흰쥐의 VCZ 노출시 사춘기 개시의 지연효과는 시상하부-뇌하수체 신경내분비 축의 GnRH와 KiSS-1같은 성선자극호르몬들과 그들의 상위조절인자들의 전사 활성의 감소에 의해 야기되고, 아마도 nitric oxide (NO) 신호전달경로에 의해 조절됨을 시사한다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제4권2호
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• pp.231-236
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• 2000

Gonadotropin-releasing hormone (GnRH)과 그 수용체가 흰쥐의 난소, 정소, 자궁, 태 반 그리고 유선 등의 생식기관에서 발현됨이 알려져 있다. 더욱이, 뇌하수체 전엽에 작용하는 GnRH의 표적 산물로 알려진 luteinizing hormone (LH)이 흰쥐 생식소에서도 발현됨이 알려졌는데, 이는 생식소 내에 GnRH-LH로 이루어진 국부 회로 (local circuit)가 존재함을 시사하는 것이다 본 연구는 LH와 그 수용체 유전자가 흰쥐 유선에서도 발현되는가를 규명한 것이다. 이를 위해 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)과 LH 방사면역측정법 (radioimmunoassay, RIA)을 사용하였다. RT-PCR을 시행한 결과 생식 주기중인 임신하지 않은 흰쥐 유선에서 뇌하수체 유형의 LH${\beta}$ 전사체 (exon 1-3)가 증폭되었으나 정소특이적 LH${\beta}$ exon 부분은 검출되지 않았다. 뇌하수체 glycoprotein hormone에서 공통적으로 존재하는 ${\alpha}$-subunit과 LH 수용체에 대한 전사체 역시 흰쥐 유선에 존재함이 확인되었다. 또한 기존의 보고에서 수유중인 흰쥐 유선에서만 발현된다고 알려진 GnRH가 임신하지 않은 흰쥐 유선에서도 발현됨을 확인하였다. LH 방사면역측정법을 시행한 결과 흰쥐 유선조직 추출물에서 immunoreactive LH분자들이 검출되었으며, LH standard curve와 parallelism을 보이므로 흰쥐 유선의 LH가 뇌하수체 형과 동일할 가능성을 확인하였다. 본 연구는 흰쥐 유선에서 LH subunit들과 수용체 유전자가 발현됨을 최초로 보고한 것으로서, 흰쥐 유선이 LH의 생성처이면서 동시에 작용처이며 유선에서 합성된 GnRH의 조절하에 국부적인 인자로 작용할 가능성을 시사한다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제34권1호
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• pp.33-40
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• 2010

Equine chorionic gonadotropin (eCG) is a heavily glycosylated glycoprotein composed of non-covalently linked $\alpha$- and $\beta$-subunits. To study the function and signal transduction of tethered recombinant-eCG (rec-eCG), a single chain eCG molecule was constructed, and the rec-eCG protein was prepared. In this study, we constructed 5 mutants (${\Delta}1$, ${\Delta}2$, ${\Delta}3$, ${\Delta}4$, and ${\Delta}5$) of rec-eCG using data about known glycoprotein hormones to analyze the role of specific follicle stimulating homone (FSH)-like activity. Three amino acids of certain specific sites were replaced with alanine. The expression vectors were transfected into CHO cells and subjected to G418 selection for 2~3 weeks. The media were collected and the quantity of secreted tethered rec-eCGs was quantified by ELISA. The LH- and FSH-like activities were assayed in terms of cAMP production by rat LH/CG and rat FSH receptors. Then, the metabolic clearance rate analyzed by the injection of rec-eCG (5 IU) into the tail vein was analyzed. The mutant eCGs (${\Delta}l$, ${\Delta}4$, and ${\Delta}5$) were transcripted, but not translated into proteins. Rec-eCG A2 was secreted in much lower amounts than the wild type. Only the rec-eCG ${\Delta}3$ ($\beta$-subunit: $Gln^{94}-Ile^{95}-Lys^{96}{\rightarrow}Ala^{94}-Ala^{95}-Ala^{96}$) was efficiently secreted. Although activity is low, its LH-like activity was similar to that of tethered $eCG{\beta\alpha}$. However, the FSH-like activity of rec-$eCG{\beta\alpha\Delta}3$ was completely flat. The result of the analysis of the metabolic clearance rate shoed the persistence of the mutant in the blood until 4 hours after the injection. After then, it almost disappeared at 8 hours. Taken together, these data suggest that 94~96 amino acid sequences in eCG $\beta$-subunit appear to be of utmost importance for signal transduction of the FSH receptor.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제20권1호
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• pp.51-61
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• 2016

Neurokinin B (NKB) and neurokinin B related peptide (NKBRP) belong to tachykinin peptide family. They act as a neurotransmitter and/or neuromodulator. Mutation of NKB and/or its cognate receptor, NK3R resulted in hypogonadotropic hypogonadism in mammals, implying a strong involvement of NKB/NK3R system in controlling mammalian reproduction. Teleosts possess NKBRP as well as NKB, but their roles in fish reproduction need to be clarified. In this study, NKB and NKBRP coding gene (tac3) was cloned from Nile tilapia and sequenced. Based on the sequence, Nile tilapia NKB and NKBRP peptide were synthesized and their biological potencies were tested in vitro pituitary culture. The synthetic NKBRP showed direct inhibitory effect on the expression of GTH subunits at the pituitary level. This inhibitory effect was confirmed in vivo by means of intraperitoneal (ip) injection of synthetic NKB and NKBRP to mature female tilapia (20 pmol/g body weight [BW]). Both NKB and NKBRP had no effect on the plasma level of sex steroids, E2 and 11-KT. However, NKBRP caused declines of expression level of GnRH I, Kiss2 and tac3 mRNAs in the brain while NKB seemed to have no distinct effect. These results indicate some inhibitory roles of NKBRP in reproduction of mature female Nile tilapia, although their exact functions are not clear at the moment.

• 한국가축번식학회지
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• 제24권2호
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• pp.125-142
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• 2000

임신초기 말의 태반으로부터 분비되는 융모성성선자극 호르몬 (eCG)은 황체형성 (LH), 난포자극 (FSH) 및 갑상선자극 (TSH) 호르몬과 같이 알파 및 베타 단체의 비공유결합으로 구성되어져 있는 당단백질 호르몬이다. 알파단체의 아미노산 배열은 동물종내에서 동일하지만, 베타단체는 호르몬에 따라 작용의 특이성을 가지고 있다고 알려져 있다. 말의 융모성 성선자극 호르몬은 모체의 자궁내막에 침입한 태아 유래의 융모조직 (자궁내막배)에서 합성ㆍ분비되어진다. eCG 는 당단백칠 호르몬중 탄수화물 함량이 40% 이상으로 가장 많이 함유되어 있으며, 알파단체는 두 개의 N-linked 당쇄첨가 부위 (아미노산 56 및 82번), 베타단체는 13번에 1개의 N -linked 당쇄첨가 부위와 카르복실기 말단부위에 적어도 11개의 O-linked 당쇄첨가 부위를 가지고 있는 것이 특징이다. 또한, eCG 는 다른 동물에 있어서 강력한 난포자극 및 황체형성 호르몬의 기능을 가지고 있는 아주 특이한 호르몬이다. 말의 태반과 뇌하수체 조직으로부터 eCG $\alpha$ 및 $\beta$ 단체와 eFSH $\beta$ 단체의 cDNA를 cloning 하였으며, 각 단체의 mRNA 발현은 태반과 뇌하수체에서 독립적으로 조절되어진다. 따라서, eCG 의 기능 및 수용체에 대한 호르몬의 특이한 작용을 분자생물학, 생화학적인 측면에서 연구하는데 아주 흥미로운 호르몬이다. 왜 eCG 가 이러한 이중활성을 가지고 있는지에 대해서는 아직까지 구체적으로 연구된 바가 없지만, 지금까지의 eCG 연구를 종합하면, eCG 의 알파 및 베타 단체 의 cDNA 의 유전자 구조 (알파단체는 96개 아미노산 ; 베타단체는 149개아미노산) 가 밝혀짐으로서 각각의 당쇄첨가 부위에 대한 기능연구에 박차를 가하게 될 것으로 보인다. 따라서 Site-directed mutagenesis 를 활용 어느 특정부위의 당쇄 수식이 없는 유전자 재조합 eCG 에 대한 연구로 이들 당단백질 호르몬에 대한 생물학적 특성에 대해서 확실하게 밝혀질 것으로 기대하고, 이러한 연구가 계속 진행되고 있으며, 가까운 미래에 eCG 에 있어서 지금까지 의문으로 남아있는 난포자극 및 황체형성의 이중활성에 대한 당쇄의 기능이 완전히 해결될 것으로 기대한다. eCG 의 황체형성에 대한 당쇄의 기능은 본 연구팀에 의해 알파단체의 56 번 N-linked 당쇄첨가 부위가 필수불가결하다는 결과를 얻었지만, 앞으로 난포자극 활성에 미치는 당쇄의 중요성에 관해서는 현재 연구 중에 있다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.54-54
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• 2001

Human chorionic gonadotropin (hCG) is a member of the glycoprotein hormone family which includes FSH, hCG, TSH. These hormone family is characterized by a heterodimeric structure composed a common $\alpha$-subunit noncovalently linked to a hormone specific $\beta$-subunit. The correct conformation of the heterodimer is also important for efficient secretion, hormone-specific post-translational modifications, receptor binding and signal transduciton. To determine $\alpha$ and $\beta$-subunits can be synthesized as a single polypeptide chain (tethered-hCG) and also display biological activity, the tethered-hCG molecule by fusing the carboxyl terminus of the hCG $\beta$-subunit to the amino terminus of the $\alpha$-subunit was constructed and transfected into chinese hamster ovary (CHO-K1) cells. We also constructed C-terminal deletion mutants (D9l, D89, D88, D87, D86, D84, D83) of single chain hCG to determine the biological function (secretion, LH-activity, receptor binding, cAMP production) of these mutants. Between six and eight stably transfected pools of cells expressing wild type and mutant hCGs were selected for neomycin resistant. The hCGs secreted by the stably transfected cells into serum-free media were collected and quantified by radioimmunoassay, as described in protocol (DPC(hCG IRMA). LH activity was in terms of testosterone production and aromatase activity in primary cultured rat Leydig cells. The tethered-wthCG was efficiently secreted and showed similar LH-like activity to the dimeric hCG. The D83hCG mutant was not detected in this assay. It is suggest that hCG C-terminal part is very important for hCG secretion. Now, we checking the LH-like activity of these mutant hCGs. These data indicate that the constructs of tethered molecule will be useful in the study of mutants that affect subunit association and/or secretion.

• 대한약리학회지
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• 제30권1호
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• pp.19-28
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• 1994

흰쥐의 뇌하수체 전엽배양세포에 gonadotropin-releasing hormone (GnRH)을 처리하였을 때 시간이 경과함에 따라 GnRH농도에 비례하여 luteinizing hormone(LH)의 분비가 증가하였으며, 2시간까지 급격하게 증가하였다. 또한 GnRH를 처리하였을때 ${\alpha}$ subunit mRNA의 농도는 증가하지 않았으나 $LH{\beta}$ subunit mRNA의 농도는 GnRH 농도에 비례하여 증가하였으며, GnRH 처리후 6시간 이후부터 유의하게 증가하였다. 특히 최종농도가 $2{\times}10^{-10}M$이 되도록 GnRH를 처리하였을 때 $LH{\beta}$ subunit mRNA 농도가 2.7배 정도 최대로 증가하였다. 또한 estradiol을 단독으로 또는 GnRH와 동시에 처리하였을때 LH분비가 증가하지 않았으나 progesterone을 GnRH와 동시에 처리하였을때 LH분비가 유의하게 증가하였다. 또한 $LH{\beta}$ subunit mRNA의 농도는 estradiol및 progesterone을 단독으로 또는 GnRH와 동시에 처리하였을때 난소호르몬 농도에 의존적으로 $LH{\beta}$ subunit mRNA의 농도가 증가하였다. Estradiol에 의한 $LH{\beta}$ subunit mRNA의 증가양상은 estrogen 길항제인 LY117018에 의하여 유의하게 감소하였다. 이러한 결과로 보아 GnRH는 steady state $LH{\beta}$ subunit mRNA 농도에 영향을 미치므로써 LH분비 및 LH subunit 생합성을 조절하며 난소호르몬은 뇌하수체에 직접 작용하여 LH분비 및 LH subunit 생합성에 영향을 주는 것으로 보인다.

• 대한약리학회지
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• 제29권2호
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• pp.225-235
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• 1993

난소호르몬에 의하여 황체형성호르몬(luteinizing hormone; LH) subunit의 유전자 발현이 어떻게 조절되는가를 조사하기 위하여 성숙한 흰쥐에서 난소를 제거하거나 또한 난소호르몬을 재 투여한 후 ${\alpha}$ 및 $LH{\beta}$ subunit mRNA의 수준을 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 난소를 제거한 후 시간이 경과함에 따라 혈중 LH 농도 및 뇌하수체 LH 함량이 급격히 증가하였다. 또한 난소제거 후 14일 후부터 ${\alpha}$ subunit mRNA 수준이 증가하기 시작하였으며, $LH{\beta}$ subunit mRNA 수준은 난소제거 후 1일부터 증가하기 시작하여 혈중 LH 농도와 같은 양상으로 증가하였다. 2. 난소제거 후 21일 경과후에 난소호르몬을 투여하였을때 난소제거로 증가된 혈중 LH 농도와 ${\alpha}$ 및 $LH{\beta}$ subunit mRNA 수준이 감소하였다. Estradiol을 1일간 투여하였을때 부터 혈중 LH 농도 및 ${\alpha}$와 $LH{\beta}$ subunit mRNA 수준이 감소하였으며, progesterone을 4일간 처리하였을때에 혈중 LH농도가 감소하였다. 3. Estrogen 길항제인 LY117018를 estradiol과 동시에 처리하거나, progesterone 길항제인 RU 456을 progesterone과 동시에 처리하였을때 estradiol과 porgesterone에 의하여 감소되었던 혈중 LH 농도 및 ${\alpha}$와 $LH{\beta}$ subunit mRNA 수준이 유의하게 회복되었다. 이상의 결과로 보아 LH 분비에 있어서 $LH{\beta}$ subunit mRHA 수준의 변화가 속도결정단계 (rate limiting step)인 것으로 보이며, 난소홀몬은 ${\alpha}$ 및 $LH{\beta}$ subunit mRNA 수준을 조절하므로써 pretranslation 단계에서 LH 생합성을 조절하는 것으로 생각된다.