본 연구에서는 cellulase를 보다 경제적으로 생산하기 위해 다양한 리그노셀룰로스계 폐기물 기질에 대해 cellulase 생산을 검토, 비교하였으며 가능성이 높은 기질에 대해 대량 생산 실험을 수행하였다. 폐 신문지는 0.2% NaOH를 사용하여 전처리한 경우 FPase와 CMCase의 최대활성이 각각 0.25 IU/mL, 4.6 IU/mL로 좋았으나, 폭쇄재 및 당화잔사 등 다른 기질의 최대활성인 0.6∼0.8 IU/mL, 5.5∼6.5 IU/mL에 비해 매우 낮았다. 30 L 발효기를 이용한 cellulase 생산 실험에서 FPase 최대활성은 lactose와 폭쇄재에서 각각 0.75 IU/mL, 0.72 IU/mL로서 당화 잔사의 최대 활성인 0.58 IU/mL에 비해 30% 높았으나 CMCase는 당화 잔사에서 최대활성이 6.3 IU/mL로 폭쇄재를 기질로 하였을 때 보다 15%높았다.
본 연구에서는 음식물쓰레기를 당화시키기 위해 섬유소분해효소를 효율적으로 배양하고자 먼저 refill하는 멘델배지의 농도를 0.5%로, 새로운 배지의 주입시간을 12시간으로 결정하였다. Flask 레벨에서는 fill-and-draw 방법으로 12시간 단위로 연속배양한 결과, amylase 활성은 300시간까지 1.0 U/mL 내외로 유지되었으며, FPase 활성은 156시간까지 0.40 U/mL 이상으로 유지되었다. 이때의 효소생산성은 amylase 3.49 U/L. hr, FPase 1.02 U/L. hr 이었다. 10 L에서는 batch, fed-batch, fill-and-draw 방법으로 효소를 생산한 결과 batch에서 가장 높은 효소생산성을 나타내었으며, 그다음은 fed-batch 이었다. Batch에서의 효소생산성은 amylase 42.30 U/L. hr, FPase 5.60 U/L. hr, fed-batch에서는 각각 23.03, 2.76 U/L. hr 이었다. 그리하여 T. inhamatum KSJ1을 이용한 섬유소분해효소의 연속배앙에서 10 L 생물반응기에서 fed-batch 빙법이 가장 효율적이었다.
Trichoderma reesei QM 9414를 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine으로 처리하여 얻은 돌연변이주들을 여러 탄소원에서 배양했을 때 carboxymethylcellulose(CMC), fiter paper 등의 기질에 대한 활성측정결과 다음과 같은 결과를 얻었다. 모균주가 catabolite repression을 받는 반면에 돌연변이주들의 cellulase 활성은 glucose를 탄소원으로 사용한 배지에서 모균주에 비해 CMCase 8.4배, FPase가 $5.4{\sim}5.7$배 증가함으로써 glucose-derepression성질을 갖는 돌연변이주들을 얻었으며 glucose를 탄소원으로 사용하고 lactose로 효소의 생산을 유도시켜본 결과 모균주에 비해 효소의 생산에 안정성을 갖는 것으로 나타났으며 돌연변이주 1이 상대적으로 더 우수한 돌연변이주로 나타났다. 돌연변이주들에 의해 생산된 효소는 모균주와 마찬가지로 pH 4.8, $60^{\circ}C$에서 최적활성을 나타내었다.
Tyichoderma viride가 생산하는 cellobiohydrolase의 열불활화 특성을 잔류효소역가 측정방법과 면역학적 정량방법으로 측정하였다. 정제된 cellobiohydrolase의 열불활 곡선은 Arrhenius plots에서 직선관계를 가졌고 이 때의 Z-값은 carboxymethyl cellulase의 정량시 5.2$^{\circ}C$, filter pa per degradation activity 정량시 6.4$^{\circ}C$, Immunoassay시 5.8$^{\circ}C$로 각기 나타났다. 열역학 상수 산출시는 immunoassay 와 filter paper degradation activity 측정이 carboxymethyl cellulase의 역가 측정보다 잘 일치하는 것을 알 수 있었다.
This study was carried out to select the useful bacteria which secret extracellula enzymes for enzymatic deinking agent of old newspaper. CMCase, FPase and xylanase activities of the bacteria liquid culture were measured at optimal growth conditions. Clear zone test was checked on the solid culture. The results of this study were as follow: Eight strains of 28 bacteria isolated from a paper mill soil ground were shown strong CMCase and xylanase activity with the clear zone test. The optimal pH and temperature for culture growth were 6~8 and 26~$34^{\circ}C$, respectively and optimal culture period were less than 60 hours. Based on CMCase, FPase and xylanase activity, strain No. 18, 21, 22 and 28 which were relatively higher than the other strains, were selected for further enzymatic deinking research.
A bacterium, isolated from rabbit's waste and identified as Cellulomonas sp., had cellulase and thermostable $\alpha$-amylase activity when grown on wheat bran. Maximum activity of thermostable $\alpha$-amylase was obtained by adding $3\%$ soluble starch. However, soybean oil (1 ml $1^{-1}$) could increase the production of $\alpha$-amylase and cellulase in 'wheat bran. The $\alpha$-amylase was characterized by making a . demonstration of optimum activity at $90^{\circ}C$ and pH 6- 9, with soluble starch as a substrate. The effect of ions on the activity and the stability of this enzyme were investigated. This strain secreted carboxymethyl cellulase (CMCase), cellobiase ($\beta$glucosidase), and filter paperase (Fpase) during growth on wheat bran. Carboxymethy1cellulase, cellobiase, and Fpase activities had pH optima of 6, 5.5, and 6, respectively. CMCase and cellobiase activities both had an optimum temperature of $50^{\circ}C$, whereas Fpase had an optimum temperature of $45^{\circ}C$.
The useful fungi which secret extracellular enzymes was selected for deinking agent of old newsprint. Five fungal strains were isolated from a paper mill soil ground. The CMCase, FPase and xylanase activities of fungi on the liquid culture were investigated at optimal growth conditions. The results of this study were as follow: The optimal pH and temperature for culture growth were 4~8 and 27~$35^{\circ}C$, respectively. For screening of extracellular enzymes at optimal culture conditions the optimal culture period were less than 6-7 days. Fusarium pallidoroseum and Aspergiilus niger which shows relatively higher CMCase, FPase and xylanase activities than the other species were selected for further enzymatic deinking research.
한국펄프종이공학회 1999년도 Pre-symposium of the 10th ISWPC Recent Advances in Paper Science and Technology
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pp.291-295
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1999
Coprinus cinereus 2249 that is a kind of basidiomycetes constitutively produced alkaline carboxymethyl cellulase (CMCase), filter paper cellulase (FPase) and xylanase. Crude enzymes prepared with optimal conditions showed higher FPase activity than CMCase activity. The FPase was most active at pH 9 at 50$^{\circ}C$. When applied on deinking of the old newsprint (ONP), it increases the freeness and brightness due to effect of hydrolysis at 0.1% enzyme concentration. Also, The physical properties of deinked pulp were improved.
The various culture conditions of Trichoderma viride(ATCC 3454) and Phanerochaete chrysosporium(ATCC 26921) with glucose-pepton medium, Mandels medium, YMG medium for wood degradable enzyme were examined. Mycellium of the two species grew profusely on glucose-pepton medium. Maximum fungal growth was observed about 10days. But CMCase, Fpase, laccase activity in the culture medium with glucose-pepton was not detected. When grown in fermenter culture using Mandels medium, Trichoderma viride produced CMCase and Fpase. Its CMCase activity was 0.15 lU/ml and Fpase activity was 0.3 IU/ml within about 4-6days. Phanerochaete chrysosporium grown in a YMG medium gave the best enzyme activity when they were grown under stationary culture with an atmosphere of 100% oxygen. Levels of laccase activity of 3.0 mull were achieved in stationary culture under 100% oxygen. The enzyme condensation by ultrafiltration method caused a 2-fold(cellulase) and 6-fold(laccase) as compared to control activity.
섬유소를 분해하여 이용하기 위해서는 섬유소 분해효소를 대량으로 생산하는 것이 중요하며 이를 위해서는 적절한 탄소원을 이용하여 섬유소 분해효소의 대량생산을 유도하는 것이 중요하다. 본 실험에서는 Trichoderma reesei Rut C-30을 섬유소 분해효소의 생산 균주로 solka floc을 탄소원으로 사용하여 섬유소 분해효소의 활성을 증가시키기 위한 배지내 최적 농도가 1%이고 포도당이 0.5%이상 배지에 첨가 될 경우 섬유소 분해효소의 생산이 저해됨을 알 수 있었다. 정제된 섬유소인 solka floc이 목질섬유소인 wheat bran과 함께 탄소원으로 사용되었을 때 각각을 섬유소 분해효소 생산의 유도 물질로 이용했을 때보다 더 높은 CMCase 활성과 FPase 활성을 보였다. Solka floe 1%와 wheat bran 3%을 탄소원으로 사용한 배지의 CMCase 활성이 76 U/ml, FPase 활성이 12.6 U/ml로 가장 높은 값을 나타내었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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