• 한국식품영양과학회지
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• 제25권4호
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• pp.687-694
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• 1996

한국산 겨자에서 myrosinase를 분리 및 정제하고, 이들의 효소학적 특성을 조사한 결과는 다음과 같다. 겨자 myrosinase를 DEAE-cellulose, Concanavalin A-Sepharose 및 FPLC Soporose 6 칼럼을 이용하여 분리 및 정제하였을 때 적어도 3개의 이성효소가 존재하는 것으로 나타났으며, Myrosinase II-2의 최종 비활성도는 57.lunits/mg, 정제도는 약 248배였다. SDS-PAGE상에서 myrosinase(II-2)의 단일밴드를 확인한 결과, 그 분자량은 약 67KD로 추정 되었다. 최적 pH는 phosphate 및 Tris-HCI 완충액에서 7.0이 가장 활성이 높았고, 그 효소는 pH 7.0에서 안정하였으며, 최적 활성을 나타내는 온도는 $37^{\circ}C$ 부근이었고, $40^{\circ}C$ 이상에서는 비교적 불안정하게 나타났다. Ascorbic acid의 영향은 1mM에서 가장 안정하였으며, 그 이상의 농도에서는 변화가 없었다. 망간과 마그네슘 및 나트륨은 효소활성을 촉진시키는 것으로 나타났으며 구리, 수은 및 철 이온은 약간 저해하였다. Ascorbic acid analogue 중 dehydroascorbic acid는 효소 활성을 저해하였으며, 나머지 것들은 거의 영향을 미치지 않았다. 2-Mer-captoethanol과 dithiothreitol과 같은 환원제는 효소활성을 억제하였으나 이들과 ascorbic acid를 함께 첨가 하였을 때는 활성이 다소 증가하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제15권5호
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• pp.1047-1053
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• 2005

Cyclosporin A binding protein type-19 kDa peptidyl-prolyl cis/trans isomerase (PPIases, EC 5.2.1.8) of Euglena gracilis was purified and some of its biochemical characters were elucidated. Purification of the PPIase was achieved by employing a series of steps involving ammonium sulfate precipitation, Superdex G-75 gel filtration chromatography, Mono­Q anion and Mono-S cation exchange chromatographies, and Superdex S-200 gel filtration chromatography on FPLC. Purified PPIase had a specific activity of 8,250 units/mg, showing a 27-fold increase compared with that of cell-free extract of Euglena gracilis. The enzyme consisted of a single polypeptide chain with a molecular mass of 19 kDa. It showed high substrate specificity to succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide, and $k_{car}/K_{m}$, for this substrate was found to be $61.19{\times}10^5/sec$. The isomer distributions were investigated at an equilibrium of seven different peptide substrates, varying Xaa in Suc-Ala-Xaa-Pro-Phe-p-nitroanilide in dimethylsulfoxide. The cis/trans equilibrium constants were estimated to be from 0.14 (Ile) to 0.63 (Gly), which correspond to $12.00\%\;to\;38.52\%$ of the cis population, respectively, under experimental condition. The enzyme was highly sensitive to the immunosuppressive ligand cyclosporin A, but not to other immunosuppressants such as FK506 and rapamycin. Thus, it appears to belong to the class of cyclophilin.

• 생명과학회지
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• 제17권8호통권88호
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• pp.1046-1052
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• 2007

Transferrin은 저장된 철분자를 운반하고 살아있는 유기체에서 철의 항상성을 유지한다. 호랑나비의 종령 유충 혈림프내 철 운반 단백질인 transferrin을 KBr 밀도구배 초원심분리와 Superose 6 HR을 이용한 fast protein liquid chromatography법으로 분리 정제하였으며, transferrin의 조직에 따른 분포는 면역화학적 방법에 따라 확인하였다. 정제된 transferrin의 아미노산 조성은 아스파르트산(Asp), 발린(Val), 루이신(Leu), 글루타민(GIu)이 많이 존재하였으며, subunit의 분자량은 78, 80 kDa으로 확인되었다. Immuno-diffusion을 통해 각 조직에서 분포를 확인한 결과 혈림프와 지방체에서 transferrin이 전시기에 걸쳐 뚜렷한 동질성을 나타냈다. 또한 rocket immuno-electrophresis법에 의해 transferrin의 양적 분포를 살펴보면 혈림프에서 용화 3일과 용화 5일에 증가하였으며, 지방체에서는 전용기와 용화직후에 양적인 증가를 나타냈다.

• International Journal of Industrial Entomology and Biomaterials
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• 제2권2호
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• pp.161-166
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• 2001

The storage proteins of the mulberry longicorn beetle, Apriona germari Hope, were purified and characterized. Three kinds of storage protein (SP1, SP2 and Sp3) were purified from the last instar larval hemolymph of A. germari by the FPLC techniques, anion exchange chromatography and gel permeation chromatography. The SP1, SP2 and SP3 have a native molecular weight of 480, 440 and 420 kDa, respectively. In the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis, these storage proteins are composed of a single protein subunit with molecular weight of 90, 85 and 80 kDa, respectively. This result showed that the storage proteins are hexameric protein. The SP1 and SP2 were stained with Schiffs reagent, but SP3 was not stained. It can be assumed that SP1 and SP2 are glycoprotein. Western blot analyses using the each of polyclonal antiserum against purified SP1, SP2 and SP3 showed that the three antibodies reacted with the each of SP bands, respectively. Also, antibodies against SP1 and SP3 cross-reacted with the SP3 and SP1, respectively. However, SP2 was not cross-reacted with these two antibodies. Also, antiserum against SP2 did not cross-reacted with the SP1 and SP3.

• 한국식품과학회지
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• 제34권4호
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• pp.552-558
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• 2002

팽나무버섯(Flammulina velutipes)에서 polyphenol oxidase가 황산암모늄 침전법, Superdex G-75 겔여과크로마토그래피, Phenyl superose 친화크로마토그래피, Mono-Q 이온교환수지 크로마토그래피, 그리고 Superdex S-200 겔크로마토그래피 등의 과정으로 정제되었으며, 특성화 되었다. 정제된 효소의 비활성도는 199.1 units/mg으로 나타났으며, 이 효소는 40 kDa의 단일폴리펩티드 사슬로 구성되어 있음이 밝혀졌다. 효소반응의 최적 pH와 온도는 각각 6.0과 $25^{\circ}C$,이었으며, pH 3과 5 사이의 산성조건과, pH 8과 10 사이의 알카리 조건에서는 활성이 감소되거나 상실되었다. 이 효소는 L-DOPA와 caffeic acid 등의 o-diphenols류에 대하여 높은 효소활성을 나타내었으며, L-DOPA와 caffeic acid에 대한 Km 값은 각각 3.97mM과 1.78mM로 계산되었다. 2-mercaptoethanol, L-ascorbic acid, sodium bisulfite, EDTA와 $Mg^{2+}$은 팽나무버섯 pholyphenol oxidase의 효소활성을 감소시켰으며, $Cu^{2+}$, $Fe^{2+}$, $Zn^{2+}$ and $Ni^{2+}$ 등은 효소의 활성을 촉진하는 인자로 밝혀졌다. 정제된 효소는 $-70^{\circ}C$에서 3개월, 그리고 $-20^{\circ}C$에서 1개월간 활성의 손실 없이 저장이 가능하였다.

• 한국식품과학회지
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• 제30권4호
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• pp.988-991
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• 1998

소와 돼지 혈액중의 혈장 단백질을 분리하여, 성분 분석과 단백질 함량을 정량했으며 혈장단백질의 식품 기능성에 관하여서는 기존 유화제로서 활용되는 유청 단백질인 WPC와 비교하여 유화능력을 비교 검토하였다. FPLC 및 SDS-PAGE에 의한 성분분석 결과 혈장 알부민(SA)은 돈혈장단백질(PPP), 우혈장단백질(BPP), 유장단백질(WPC)의 순서로 많이 함유되었으며, 혈장 단백질에는 ${\beta}-globulin$분획(주로 transferrin)이 다량 포함되어 있고, 그외 미량성분(fibrinogen, immunoglobulin)들이 확인되었다. 단백질 함량은 BPP (85%) 및 PPP (82%) 모두 높은 함량을 보여 우수한 단백질원으로 이용 가능할 것으로 보였다. 유화력도 혈장단백질들이 단백질 농도 2% 이하에서는 WPC보다 높았으며, 4% 이상에서는 WPC보다는 약간 낮았다. 또한 염농도 및 pH 의존성에 관하여 유화력에 미치는 영향을 검토한 결과, PPP 및 BPP의 pH 영역에 대한 유화활성은 WPC와는 상이하게 산성쪽의 pH에서 염기성쪽보다 더 높은 활성을 보였으며, 염(NaCl)첨가로 인한 유화 활성의 영향은 WPC와 비교하여 pH 의존성이 상당히 높았으며, 특히 산성쪽에서 높은 활성을 나타냈다. 이상의 결과들을 살펴볼 때 소 및 돼지의 혈액에서 제조한 혈장단백질들은 우수한 유화특성을 갖는 식품소재로 확인되었다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제43권4호
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• pp.547-557
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• 1996

연구배경 : 호중구는 성인형 호흡곤란증후군, 폐기종 및 원발성 폐섬유화증 등 여러 폐질환에서 과도하게 폐에 침착되어 여러 가지 독설 물질을 분비하여 조직 손상을 일으키는 것으로 알려져 있어, 말초혈액 호중구가 폐포나 간질조직으로 이동하는 기전을 이해하는 것은 매우 중요하다. 저자들은 급성 폐손상의 동물실험모델로 흰쥐에 고농도 산소를 추여하여 급성 폐손상을 일으킨 후 기관지폐포세척액내 호중구 및 호중구에 대한 화학주성능이 증가하였는지 그리고 이러한 변화가 고농도산소 노출 시간에 따라 차이가 있는지를 관찰하였으며, 또한 호중구 화학주성인자의 분자량 및 물리적 특성을 알아보았다. 방법 : 고농도산소를 투여할수 있는 기구(hyperoxic chamber)를 만들어 95%이상의 산소를 흰쥐에 24, 48, 60, 72시간 투여하였으며 각군의 쥐에서 기관지폐포세척을 실시하여 얻은 세척액내 호중구의 증가여부를 관찰하였고 호중구의 화학주성능은 정상인의 말초혈액내 호중구를 대상으로 Neuroprobe 48 well chemotactic chamber를 이용하여 계산하였다. 또한 기관지 폐포세척액을 열처리하거나 cellulose membrane에 filter 시켰을 때 화학주성능의 변화여부를 관찰하였고 FPLC(Fast performance liquid chromatography)로 분자량을 측정하였다. 결과 : 1) 기관지폐포세척액내 호중구는 대조군에 비해 고농도 산소 노출 48시간에서부터 증가하여 노출 시간이 길수록 유의하게 증가하였다. 2) 기관지폐포세척액의 호중구 화학주성능 (chemotactic index)도 대조군에 비해 고농도 산소 노출 48시간에부터 유의하게 증가하기 시작하여 노출 시간이 길수록 유의하게 증가되었다. 3) 흰쥐는 48시간까지는 한마리도 사망하지 않았으나 60시간에 33.3 %, 72시간에 81.3 %의 사망률로 현저히 증가하였다. 4) FPLC를 이용하여 호중구 화학주성인자를 분석하였을 때 chemotactic index는 분자량이 104,000과 12,000 dalton에서 peak를 나타냈다. 5) 48시간과 60시간 및 72시간 노출군에서 기관지폐포세척액을 $56^{\circ}C$에서 30분과 $100^{\circ}C$에서 10된 열처리 후 chemotactic index는 열처리 전보다 모두 유의하게 감소하였으며, 48시간과 60시간 노출군에서 12,000 dalton 이하의 물질을 dialysis 후 chemotactic index도 dialysid 전에 비해 유의하게 감소하였다. 결론 : 이상의 결과로서 흰쥐에 고농도의 산소를 40시간 이상 노출시키면 기관지폐포세척액에 호중구 화학주성인자가 증가되고 그에 따라 호중구가 폐에 증가하여 급성 폐손상을 일으키고, 이때 나타나는 호중구 화학주성인자는 분자량이 작은 것 뿐 아니라 큰 것까지 다양하며, 열에 대해 약한 것 뿐 아니라 강한 성분 등 여러가지가 있음을 관찰하였으며 앞으로 이들 성분에 대한 연구가 더욱 진행되어야 할 것으로 생각된다.

• Journal of Microbiology
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• 제44권6호
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• pp.622-631
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• 2006

In this study we purified a fibrinolytic enzyme from Cordyceps militaris using a combination of ion-exchange chromatography on a DEAE Sephadex A-50 column, gel filtration chromatography on a Sephadex G-75 column, and FPLC on a HiLoad 16/60 Superdex 75 column. This purification protocol resulted in a 191.8-fold purification of the enzyme and a final yield of 12.9 %. The molecular mass of the purified enzyme was estimated to be 52 kDa by SDS-PAGE, fibrin-zymography, and gel filtration chromatography. The first 19 amino acid residues of the N-terminal sequence were ALTTQSNV THGLATISLRQ, which is similar to the subtilisin-like serine protease PR1J from Metarhizium anisopliae var. anisopliase. This enzyme is a neutral protease with an optimal reaction pH and temperature of 7.4 and $37^{\circ}C$, respectively. Results for the fibrinolysis pattern showed that the enzyme rapidly hydrolyzed the fibrin $\alpha$-chain followed by the $\gamma$-$\gamma$ chains. It also hydrolyzed the $\beta$-chain, but more slowly. The A$\alpha$, B$\beta$, and $\gamma$ chains of fibrinogen were also cleaved very rapidly. We found that enzyme activity was inhibited by $Cu^{2+}$ and $Co^{2+}$, but enhanced by the additions of $Ca^{2+}$ and $Mg^{2+}$ ions. Furthermore, fibrinolytic enzyme activity was potently inhibited by PMSF and APMSF. This enzyme exhibited a high specificity for the chymotrypsin substrate S-2586 indicating it's a chymotrypsin-like serine protease. The data we present suggest that the fibrinolytic enzyme derived from the edible and medicinal mushroom Cordyceps militaris has fibrin binding activity, which allows for the local activation of the fibrin degradation pathway.

• Asian Pacific Journal of Cancer Prevention
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• 제15권20호
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• pp.8947-8950
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• 2014

Immunological functions of heat shock proteins (HSPs) have long been recognized. In this study we aimed to efficiently purify HSP70 from renal cell carcinoma and test it as a tumor antigen for pulsing dendritic cells in vitro. HSP70 was purified from renal cell carcinoma specimens by serial column chromatography on Con A-sepharose, PD-10, ADP-agarose and DEAE-cellulose, and finally subjected to fast protein liquid chromatography (FPLC). Dendritic cells derived from the adherent fraction of peripheral blood mononuclear cells were cultured in the presence of IL-4 and GM-CSF and exposed to tumor HSP70. After 24 hours, dendritic cells were phenotypically characterized by flow cytometry. T cells obtained from the non-adherent fraction of peripheral blood mononuclear cells were then co-cultured with HSP70-pulsed dendritic cells and after 3 days T cell cytotoxicity towards primary cultured renal cell carcinoma cells was examined by Cell Counting Kit-8 assay. Dendritic cells pulsed in vitro with tumor-derived HSP70 expressed higher levels of CD83, CD80, CD86 and HLA-DR maturation markers than those pulsed with tumor cell lysate and comparable to that of dendritic cells pulsed with tumor cell lysate plus TNF-${\alpha}$. Concomitantly, cytotoxic T-lymphocytes induced by HSP70-pulsed dendritic cells presented the highest cytotoxic activity. There were no significant differences when using homologous or autologous HSP70 as the tumor antigen. HSP70 can be efficiently purified by chromatography and induces in vitro dendritic cell maturation in the absence of TNF-${\alpha}$. Conspecific HSP70 may effectively be used as a tumor antigen to pulse dendritic cells in vitro.

• BMB Reports
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• 제40권5호
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• pp.832-838
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• 2007

A novel inhibitory protein against blood coagulation factor Va (FVa) was purified from muscle protein of granulated ark (Tegillarca granosa, order Arcoida, marine bivalvia) by consecutive FPLC method using anion exchange and gel permeation chromatography. In the results of ESI-QTOF tandem mass analysis and database research, it was revealed that the purified T. granosa anticoagulant protein (TGAP) has 7.7 kDa of molecular mass and its partial sequence, HTHLQRAPHPNALGYHGK, has a high identity (64%) with serine/threonine kinase derived from Rhodopirellula baltica (order Planctomycetales, marine bacteria). TGAP could potently prolong thrombin time (TT), corresponding to inhibition of thrombin (FIIa) formation. Specific factor inhibitory assay showed that TGAP inhibits FVa among the major components of prothrombinase complex. In vitro assay for direct-binding affinity using surface plasmon resonance (SPR) spectrometer indicated that TGAP could be directly bound with FVa. In addition, the binding affinity of FVa to FII was decreased by addition of TGAP in dose-dependant manner ($IC_{50}$ value = 77.9 nM). These results illustrated that TGAP might interact with a heavy chain of FVa ($FVa_H$) bound to FII in prothrombin complex. The present study elucidated that non-cytotoxic T. granosa anticoagulant protein (TGAP) bound to FVa can prolong blood coagulation time by inhibiting conversion of FII to FIIa in blood coagulation cascade. In addition, TGAP did not significantly (P < 0.05) show fibrinolytic activity and cytotoxicity on venous endothelial cell line (ECV 304).