• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제6권6호
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• pp.414-419
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• 1996

The xylnX gene encoding a xylanase from Clostridium thermocellum ATCC27405 was cloned in the plasmid pJH27, an E. coli-Bacillus shuttle vector and the resultant recombinant plasmid, pJX18 was transformed into E. coli HB101. The overexpressed xylanase was found to be secreted into the periplasmic space of the recombinant E. coli cells. The crude enzyme was obtained by treating the E. coli cells with lysozyme, and purified by DEAE-Sepharose column chromatography. Molecular wieght of the xylanase was estimated to be 53 kDa by gel filtration. The pI value was determined to be pH 8.8. The N-terminal sequence of the enzyme protein was Asp-Asp-Asn-Asn-Ala-Asn-Leu-Val-Ser-Asn which was considered to be the sequence of that of the mature form protein. The Km value of the enzyme for oat spelt xylan was calculated to be 2.63 mg/ml and the Vmax value was $0.47 {\mu}mole/min$. The xylanase had a pH optimum for its activity at pH 5.4 and a temperature optimum at $60^{\circ}C$. The enzyme hydrolyzed xylan into xylooligosaccharides which were composed mainly of xylobiose (40%) and xyloltriose (12%) after 5 hour reaction. This result indicates that the xylanase from C. thermocellum ATCC27405 is an endo-acting enzyme.

• Applied Biological Chemistry
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• 제35권1호
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• pp.23-29
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• 1992

한국산 파인애플로부터 bromelain을 추출하여 황산암모늄염석, DEAE-cellulose ion-exchange chromatography, gel filtration을 이용하여 약 21배 정제하였고, 정제효소는 전기영동상 단일밴드를 나타내었으며, 분자량은 약 22,000이었다. 정제된 bromelain은 glycine과 serine이 가장 많이 함유되어 있었으며 최적작용 pH와 온도는 6.0, $60^{\circ}C$였다. $pH\;5{\sim}7,\;50^{\circ}C$이하에서 안정성을 보였으며 $Mn^{2+}$에 의해 활성이 촉진되었고, $Mg^{2+},\;Fe^{2+}$ 등의 금속이온에 의해 급격한 활성저해가 관찰되었다. 정제효소는 p-chloromercuribenzoic acid에 의해 저해되어 SH효소로 추측되었으며, Km과 Vmax값는 각각 $5.747{\times}10^{-4}M,\;131.58\;{\mu}g/min$ 이었다. 돈육 조직에 효소를 처리하였을 때 효소 농도가 증가함에 따라 육단백질이 가수분해되어 유리되는 수용성 질소량과 아미노태 질소량이 증가되어 연육효과가 있음이 확인되었다.

• 한국식품과학회지
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• 제32권1호
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• pp.161-167
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• 2000

한국의 재래식메주로부터 분리 동정한 Aspergillus wentti가 생산하는 protease를 정제하고 그 특성을 조사하였다. 기본배지[밀기울 :1% glucose 함유$H_2O=1:1\;(w/v)]$에서의 효소생산 최적조건은 pH 9.0, $30^{\circ}C$, 4일 이었다. 효소의 정제는 먼저 배양 밀기울로부터 20mM phosphate(pH 8.0)로 효소를 추출하고 QAE-Sephadex와 SP-Sephadex의 ion exchange chromatography로 비흡착성 활성단백질을 분리한 후 두차례의 Sephadex G-100 gel filtration로서 분자량 약 32,000(SDS-PAGE분석 : 단일밴드)의 비활성도 213unit/mg, 정제배수 27.3배로 효소를 정제하였다. 본 효소의 $K_m$값은 $3.049{\times}10^{(-4)}M,\;V_(max)$값은 $151.1\;{\mu}g/min$이었으며 ISP, hemoglobin, bovine albumin 보다 casein에 대해 가수분해력이 높은 것으로 나타났다. 정제효소의 최적작용 pH와 온도는 pH 9.0, $50^{\circ}C$였으며 pH $4.0{\sim}11.0$의 범위와 $40^{\circ}C$이하에서 안정하였으며 효소활성은 금속이온에 의해 영향을 받지 않았고 2mM의 phenylmetanesulfonyl fluoride에 의해 86% 실활되었다. 이 결과로부터 본 효소는 효소 활성부위가 serine의 OH기인 serine protease인 것으로 밝혀졌다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제17권4호
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• pp.348-357
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• 1988

갈변반응에 관여하는 polyphenol oxidase(PPO : EC 1.10.3.1)를 한국산 고구마(Ipomoea batatas, val : Hong-mi)로부터 추출하여 ammoniun sulfate 분획 및 DEAE-cellulose column chromatography법에 의하여 정제한 결과, 효소활동도는 23.1배였으며 enzyme activity 수율은 41.5%이었다. 이 효소는 일반 전기 영동법에 의하여 8개의 isozymes 으로, 또한 isolectric focusing에 의하여 pI가 각각 다른 12개의 isozymes으로 분리되었고 그 pI의 범위는 3.2-9.6이었으며, Isoelectric focusing에 의하여 분리된 각 isozyme의 specific activity는 6,000-46,700U/mg protein의 범위에 있었다. 고구마 중의 PPO는 $65^{\circ}C$이하에서는 안정하였으며 $65^{\circ}C$ 에서는 1분 가열에 의하여 약 50%의 효소활성이 상실되었고, pH optimum은 6.0-6.5이었다. o-diphenol이 이 효소의 가장 좋은 기질로서, 이 효소는 o-diphenolase임이 확인되었고, catechol에 대한 Km치는 6.7mM로 나타났다. 또한 이 효소에 대한 저해작용은 dithiothreitol, cysteine 및 ascorbic acid 순으로 크게 나타났다.

• 한국동물학회지
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• 제39권1호
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• pp.36-46
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• 1996

붉은 지렁이(Lumbricus rubellus)로부터 체내에 존재하는 phenoloxidase (EPO)를 ammonium sulfate. Blue-2, Phenyl-, Q-sepharose chromatography등을 이용하여 정제하였다. 이 효소는 SDS-PAGE상에서 59 kDa의 분자량을 갖는 단일 단백질로 나타났으며 nondenatudng-PAGE를 이용하여 DL-dopa를 기질로 in situ 염색 결과, 210 kDa 보다 다소 큰 단일 band가 dopachrome 침착에 의해 형성되었다. 이는 곧 이 효소가 자연상태에서 복합체의 형태로 존재하고 있음을 의미한다. 또한 이 효소는 monophenolase 활성도, 즉 tyrosine을 dopa로 전환시키는 활성도도 갖고 있음을 470nm에서 dopachrome축적을 관찰함으로써 확인할 수 있었다. Phenyithiourea(PUT), 1, 10-phenanthroline, EDTA, EGTA등을 사용한 효소억제 실험 결과, PTU만이 65 $\mu$M의 IC 0.5로 효소 활성도를 효과적으로 억제시켰다. 이는 EPO의 촉매기작에서 구리가 매우 중요한 역할을 하고 있음을 의미한다. 이 효소는 L-dopa를 기질로 사용하였을 때 35$^{\circ}C$와 pH8.0에서 최적의 활성도를 나타내었다. EPO의 L-dopa에 대한 Km은 pH6.5와 8.0에서 각각 1.86 mM과 13.8 mM로 나타났다. 또한, pH 8.0에서 Vmax는 pH 6.5에서 보다 약 6.6배 높은 반면, 각 조건에서 촉매 효율성은 거의 차이가 없음 [(kat/Km)pH8.0/(kcat/Km)pH6.5 = O.92]을 알 수 있었다. 따라서, 이 사실은 EPO 촉매기작에 미치는 pH의 효과가 효소 자체에보다는 기질 또는 효소-기질 복합체 형성과정에 영향을 줌을 의미한다. 이와 같은 사실을 종합해 보면, L. rubellus에 존재하는 phenoloxidase는 oligomeric form을 가지며 활성화 되기 위한 제한적 단백질 가수분해를 필요로 하지 않는다. 따라서, prophenoloxidase activating system의 존재 가능성을 완전히 배재할 수는 없으나 지렁이 체내의 PO는 최소한 부분적으로나마 latent from으로 존재함을 확인할 수 있었다. 이는 외부 침입시 host를 보호하기 위한 방법으로 EPO를 latent from으로 유지 시킬 수 있는 또는 활성화 시킬 수 있는 조절기작의 존재를 예측하게 한다.

• 한국식품과학회지
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• 제21권1호
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• pp.136-144
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• 1989

무우의 myrosinase의 특성 규명을 위해 수행한 효소 정제는, 생 무우의 조효소액을 친화성 컬럼 (충진물 : Con A-Sepharose)에 흡착 시킨 후 ${\alpha}-methyl-D-mannoside$로 용출하였을 때 53%의 회수율과 16배의 정제도(S.P.A.=27,900 units/mg)를 나타내었다. 다음 단계로 gel permeation HPLC에 의해 정제한 결과, 약 50%의 최종 회수율과 22배의 정제도(S.P.A.=39,000 units/mg)를 나타내었으며, 전기 영동상 순도가 입증되었다. Gel permeation HPLC에 의해 측정한 분자량은 약 124,000 이었으며, sinigrin을 기질로 하여 측정한 Km, Vmax값은 각각 0.12mM, $40\;{\mu}moles/mg{\cdot}min$이었다. 작용 최적 pH는 6.5, 최적 온도는 $37^{\circ}C$ 이었고 중성용액(pH 6-7)에서는 상온에서 비교적 안정하였으나 산성용액 (pH 4 이하)에서는 불안정하여 효소활성도는 급격히 감소하였다. 효소의 활성화제인 아스코르브산에 의한 최대 활성화 농도는 0.6mM로 약 100배의 효소 활성도 증가효과를 나타내었으며 2mM이상에서는 효소 활성도가 저하되었다. 무우중 myrosinase의 분포는 껍질 부위에 평균 1,333 units/g, 속 부위에 평균 140 units/g으로 껍질 부위가 속 부위에 비해 10배 정도 많은 효소를 함유하고 있었다.

• 한국균학회지
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• 제25권4호통권83호
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• pp.330-339
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• 1997

식물 병원진균 Botrytis cinerea가 분비하는 polygalacturonase의 동위효소 중에서 endo-type의 polygalacturonase를 Phenyl-Toyopearl column chromatography와 DEAE-, Mono Q-, heparin-high performance liquid chromatography법으로 약 68배 정제하였고 sodium dodecylsulfate(SDS)를 포함하는 polyacrylamide gel electrophoresis로 분석하여 단일 띠를 확인하였다. 정제한 효소의 분자량은 SDS-polyacrylamide gel에서 37 kDa로 측정되었으며 약산성인 조건과 $30^{\circ}C$ 이하에서 안정하였으며 최고 활성은 pH 4.5와 $55^{\circ}C$의 온도에서 관찰되었다. 정제한 효소는 polygalacturonic acid를 endo-type으로 가수분해하였고, polygalacturonic acid에 대한 $K_m$값과 $V_{max}$값은 각각 1.1 mg/ml과 250 nmol/min이었다. N-말단의 아미노산 서열을 결정하여 본 결과, 식물이나 다른 진균류에서 보고된 아미노산 서열과 유사성이 없었다.

• 한국미생물생명공학회:학술대회논문집
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• 한국미생물생명공학회 2001년도 Proceedings of 2001 International Symposium
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• pp.40-45
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• 2001

Raw starch-digesting amylase (BF-2A, M.W. 93, 000 Da) from Bacillus circulans F-2 was converted to two components during digestion with subtilisin. Two components were separated and designated as BF-2A' (63, 000 Da) and BF-2B (30, 000 Da), respectively. BF-2A' exhibited the same hydrolysis curve for soluble starch as the original amylase (BF-2A). Moreover, the catalytic activities of original and modified enzymes were indistinguishable in $K_{m}$, Vmax for, and in their specific activity for soluble starch hydrolysis. However, its adsorbability and digestibility on raw starch was greatly decreased. Furthermore, the enzymatic action pattern on soluble starch was greatly different from that of the BF-2A. A smaller peptide (BF-2B) showed adsorb ability onto raw starch. By these results, it is suggested that the larger peptide (BF-2A') has a region responsible for the expression of the enzyme activity to hydrolyze soluble substrate, and the smaller peptide (BF-2B) plays a role on raw starch adsorption. A similar phenomenon is observed during limited proteinase K, thermolysin, and endopeptidase Glu-C proteolysis of the enzyme. Fragments resulting from proteolysis were characterized by immunoblotting with anti-RSDA. The proteolytic patterns resulting from proteinase K and subtilisin were the same, producing 63- and 30-kDa fragments. Similar patterns were obtained with endopeptidase Glu-C or thermolysin. All proteolytic digests contained a common, major 63-kDa fragment. Inactivation of RSDA activity results from splitting off the C-terminal domain. Hence, it seems probable that the protease sensitive locus is in a hinge region susceptible to cleavage. Extracellular enzymes immunoreactive toward anti-RSDA were detected through whole bacterial cultivation. Proteins of sizes 93-, 75-, 63-, 55-, 38-, and 31-kDa were immunologically identical to RSDA. Of these, the 75-kDa and 63-kDa proteins correspond to the major products of proteolysis with Glu-C and thermolysin. These results postulated that enzyme heterogeneity of the raw starch-hydrolysis system might arise from the endogeneous proteolytic activity of the bacterium. Truncated forms of rsda, in which the gene sequence encoding the conserved domain had been deleted, directed the synthesis of a functional amylase that did not bind to raw starch. This indicates that the conserved region of RSDA constitutes a raw starch-binding domain, which is distinct from the active centre. The possible role of this substrate-binding region is discussed.d.

• 한국식품영양과학회지
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• 제15권4호
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• pp.40-46
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• 1986

제1보에서 보고한 Aspergillus niger CAD 1의 beta-galactosidase를 cellulose triacetate를 담체로 하여 고정화조건을 검토하였던바, 13%(v/v)의 정제된 효소와 10%(w/v)의 cellulose triacetate를 30분간, 150stroke/min으로 진탕하면서 포괄시킨 고정화 효소의 활성이 가장 좋았다. 고정화 효소의 최적온도는 $45^{\circ}C$, 최적 pH는 4.5로서수용성 효소의 것과 같았다. 기질로서 ONPG와 유당에 대한 Km값은 각각 $8.3{\timess}10^{-3}$과 $117.0{\times}10^3M$, Vmax값은 각각 $30.3{\times}10^3M$과 $5.0{\times}10^3M$이였다. 본 고정화 효소는 $4^{\circ}C$에서 90일간 저장시에 90%, $45^{\circ}C$에서 5회 사용후에 70%의 잔존활성을 나타냈으며 유당분해율도 좋았다.

• 한국식품저장유통학회지
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• 제9권4호
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• pp.429-433
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• 2002

Candida sp. L-16 균주가 생산하는 D-xylulokinase는 배양균체를 초음파 파쇄한 조효소액으로 하여 황산암모늄 염석, DEAE-cellulose, chromatography, Sephadex G-100과 Sephadex G-200 gel filtration 과정으로 정제하여 최종 수율 11.2%로 약 23.2배 정제하였다. 정제 효소의 분자량은 SDS-PAGE로 분석한 결과 분자량은 75,000 dalton으로, Sephadex G-200겔 여과에 의해 150,000 dalton으로 나타나 dimer로 확인되었다. 효소 활성에 미치는 최적 반응 온도는 4$0^{\circ}C$로 나타났고, 온도안정성은 비교적 불안정하여 3$0^{\circ}C$이상에서는 빠르게 실활되었다. 정제 효소의 최적 반응 pH는 pH 8.0이었고, pH 7.0에서 pH 9.0 사이에서 비교적 효소활성이 높았다. 본 효소는 D-xylulose, D-arabinose, D-ribose등에서는 높은 기질특이성을 가지고 있었으나 D-xylose, D-glucose, L-arabinose 등은 기질로서 작용하지 못하였다. 정제 효소의 활성화 에너지값(Ea)은 $25^{\circ}C$ 내지 4$0^{\circ}C$$^{\circ}C$의 온도 범위에서 4.75kcal/mol이었다. 효소의 활성화제로는 EDTA, cysteine-HCl, DTT, glutathione 등이 존재하며 억제제로는 6-phosphogluconic acid, 2-koeto-gluconic acid 등으로 나타났다.