• Applied Biological Chemistry
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• 제40권6호
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• pp.478-483
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• 1997

E. coli K-12 균주에서 ${\gamma}-Glutamylcysteine$ synthetase를 정제하고 효소적 방법에 의한 글루타치온 합성에 관련된 특성을 검사하였다. 정제한 효소의 활성은 L-glutamate의 농도가 60 mM 까지 증가와 더불어 증가하였으나, 60 mM L-cysteine 에서는 50% 그리고 45 mM glycine 에서는 40%의 효소활성이 감소되었다. 효소의 활성은 반응산물 중의 하나인 ADP 뿐만 아니라 환원형 글루타치온에 의해서 감소되었다. 그러므로 환원형 글루타치온 뿐만 아니라 glutathione synthetase의 기질인 glycine은 ${\gamma}-glutamylcysteine$ synthetase 활성을 저해하므로 글루타치온 생산을 위해서는 ${\gamma}-glutamylcysteine$ synthetase 반응과 glutathione synthetase의 두 분리된 반응으로 이루어진 생반응계를 고안하는 것이 바람직하다. 또한 글루타치온 합성반응으로 부터 생성되는 ADP는 ${\gamma}-glutamylcysteine$ synthetase의 활성을 감소시키므로 글루타치온 합성을 위해서 ATP 재생계의 도입이 필요하다.

• 미생물학회지
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• 제29권5호
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• pp.278-283
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• 1991

Two amino acid residues ($Ala^{494}$ and $Ser^{495}$ of E. coli .gamma.-glutamylcysteine synthetase have been investigated whether they are the site of feedback inhibition by site specific mutagenesis. Single substitution of $serine^{495}$ (S495F), and double substitutions of alanine$^{494}$ and $serine^{495}$ (A494G-S495F) resulted in the inactivation of the .gamma.-glutamylcysteine synthetase activity. Substitution of $alanine^{494}$ with $glycine^{494}$ resulted in a higher level of feedback inhibition. These results suggest that $serine^{495}$ in .gamma.-glutamylcysteine synthetase is required for its catalytic acitvity and $alanine^{494}$ is presumably related to the feeback inhibition site.

• BMB Reports
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• 제31권3호
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• pp.254-257
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• 1998

The gshI gene from the Escherichia coli K-12 strain codes for ${\gamma}-glutamylcysteine$ synthetase which mediates the rate-limiting step of glutathione biosynthesis. The isolated gshI gene from E. coli K-12 has an unusual translation initiation codon, UUG. The 494th amino acid is Ala rather than Gly which was found in a mutant strain E. coli B. In order to improve the translational rate of the gshI gene of E. coli K-12, the initiation codon, UUG, was changed to the usual AUG codon by the site-specific mutagenesis. This change has resulted in a 53% increase of ${\gamma}-glutamylcysteine$ synthetase activity. The enzyme activity was also improved by replacing $Ala^{494}$ with Val (A494V) or Leu (A494L). The replacement of $Ser^{495}$ with Thr (S495T) also resulted in a 62% increase of the enzyme activity. Therefore, the specific activity of ${\gamma}-glutamylcysteine$ synthetase was increased with the increasing chain length of the aliphathic amino acid at the site of the 494th amino acid (Ala<$Val{\leq}Leu$).

• 생명과학회지
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• 제7권4호
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• pp.253-261
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• 1997

E. coli에서 글루타치온 생산 증가를 위해서 E. coli에서 분리한 gehI과 gshII유전자를 함유하고 있는 여러 재조합 플라스미드를 구성하여 도입하였다.pBR325 벡터에 gehI 유전자를 각각 1-3개를 포함한 재조합 플라스미드 및 gehI과 gehII 유전자를 동시에 갖는 재조합 플라스미드를 구성하였다. 계속적으로 반복된 gehI 유전자가 증폭된 E. colidml $\gamma $-gluramylcysteine synthetase의 효소활성은 삽입된 gehI 유전자의 부에 따라 증가하였다. 구성된 재조합 플라스미드를 함유한 E.coli의 글루타치온 생산능을 accetate kinase반응을 ATP재생계로 사용하여 조사한 결과 반복된 gehI 유전자를 함유한 E.coli의 글루타치온 생산능력은 삽입된 gehI 유전자의 수에 비례한여 증가하였으며, gehI 유전자의 추가적인 도입에 의해 글루타치온 생산능력은 2배 증가하였다. E.coli에서 글루타치온의 효소적 생산은 주로 \gamma $-gluramylcysteine synthetase의 효소활성에 의해 영향을 받았다. 가장 높은 글루타치온 생산능은 pGH501 (pUC8-gsh.I.II.III) 플라스미드를 갖는 균주에서 관찰되었다.

• KSBB Journal
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• 제10권3호
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• pp.249-256
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• 1995

${\gamma}$-Glutamylcysteine 생산에 있어서 재조합 대장 균 HB101/pGH501만을 이용한 단일세포반응계가 재조합 대장균과 효모를 이용한 흔합서l포반응계보다 반응시간이 짧고 생산농도가 높은 것으로 나타났다. 그러나 생산경제성 측면에서 ATP 재생공정을 위하 여 훈합세포반응계를 사용하였다. 재조합 대장균과 효모를 이용한 혼합세포반응계에서 대장균과 효모의 비율은 1:4가 적합함을 보였고, ATP 재생공정에 사용되는 glucose는 O.5M의 농도에서 가장 효율적 으로 나타났다. 재조합 대장균과 효모를 alginate를 이용하여 고정화하여 반응계로 사용하였을 경우 반 응에 필요한 시간이 걸어지고 생산놓도도 감소되냐 반응계의 안정성은 10% 정도 증가됨을 알 수 있었다. 실험결과 alginate로 고정화된 흔합세포반응계 를 사용하여 ${\gamma}$-glutamylcysteine를 연속 생산할 수 있음을 확인하였다.

• 식품기술
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• 제17권4호
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• pp.98-106
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• 2004

Two mutant enzymes of $\gamma$-glutamylcysteine synthetase ($\gamma$-GCS) which catalyzed the synthesis of $\gamma$-glutamylcysteine from L-glutamic acid and L-cysteine in the presence of ATP, were prepared bypoint mutation of $\gamma$-GCS gene with site-directed mutagensis in E. coli. Conformational structuresand catalytic reaction kinetics of mutant enzymes were compared with wild type $\gamma$-GCS afterpurification. The S495F mutant enzyme (serine at 495 residue was substituted with phenylalanine),which had no catalytic activity for $\gamma$-glutamylcysteine synthesis, rarely folded even in neutral pH.However, the mutant A494V (alanine of 494 residue was replaced by valnine) which showed 50 %increase of activity, had a high folding structure. The folding structure of A494V also more stable athigh temperature and extreme pH compared to wild type and S495F. Reaction kinetics of wild typeand A494V were also investigated, Km value of A494V was smaller than that of wild type, while itshowed a little difference at Vmax values. This result evolved that alanine at 494 may be involved inbinding site of substrate rather than catalytic site. In addition, change of catalytic activity by onepoint mutation was highly correlated with the folding structure of enzyme.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제26권3호
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• pp.213-220
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• 1998

글루타치온 생산에 필요한 ${\gamma}$-glutamylcysteine synthetase와 glutathione synthetase 효소의 활성을 위한 ATP 재생산계에 대하여 연구하였다. 글루타치온 합성용 효소를 생산하는 E. coli TG1/pDR7${\alpha}$의 최적 배양하였으며 이때 글루타치온의 생산농도는31 mg/g wet cell이었다. 빵효모를 이용한 글루타치온의 생산수율은 acetate kinase보다 낮았으나, 경제성의 면에서는 더 우수할 것으로 판단된다. ATP 재생산계로 빵효모가 Saccharomyces cerevrsiae ATCC24858보다 더 우수함을 보였다. ATP농도 5mM에서 cysteine에 대한 글루타치온의 생산 수율은 36%이었다. Cysteine의 소모에 의한 글루타치온 생산 제약을 피하기 위하여 cysteine을 반응 2시간에 추가 공급함으로써 글루타치온 생산수율을 1.91배 증가시켰다. 다양한 기질 추가 실험 결과에 의해 빵효모에 의한 ATP재생산계가 유효하고, 14mM이상의 글루타치온 농도에서는 산물저해 현상이 있는 것으로 나타났다.

• 한국결정학회지
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• 제4권2호
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• pp.100-104
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• 1993

환원된 글루타치온은 모든 세포의 대사에 중요한 역할을 하고 있다. 글루타치온은 두개의 연속적인 반응으로 합성된 세개의 펩타이드로 구성되어 있다. 첫 번째 반응에서의 촉매효소가 GSH-I 이며, 두번째 반응에서의 촉매효소가 GSH-반이다. 대장균주의 글루 타치온 합성 기작은 주로 GSH-I의 되돌림 제어에 의 해 조절되고 있다. 이러한 생화학적 작용과 구조와의 관계를 알기 위한 첫 단계로 증기 확산 방을 방법과 모세관 확산 방법으로 실온에서 결정을 얻게 되었다. GSH-I 효소의 결정은 침전제 ammonium sulfate을 사용하여 얻었으며, 증기 확산 방을 방법으로는 10 일의 기간으로 실온에서 0.2 m x 0.2 mm x 0.2 mm 크기로 자랐으며. 이 결정은 싱크로트론 X-T3y 를 사용하여 약 4.0 A 까지 회절 시켰다. 또, 모세관 을 이용한 방법으로 얻은 결정은 40일의 기간으로 실온에서 0.25 mm X 0.25 mm X 0.3 mm 의 크기로 자랐으며, 이 결정은 회전 음극선의 X-ray를 사용하여 약 4.0 A까지 회절시켰다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제19권6호
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• pp.575-582
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• 1991

글루타치온 생산증대를 도모하기 위하여 글루타치온 합성에 관여하는 효소들인 GSH-I 및 GSH-II 유전자들 pBR322 벡터에 클로닝하였다. gshI 유전자를 클로닝하기 위하여 GSH-I 효소활성이 결여된 GS903 균주를 분리하였다. E. coli K-12 염색체 DNA로부터 분리된 3.6Kb PstI DNA 절편을 pBR322 벡터에 클로닝하였다. gshII 유전자는 2.2Kb PstI-BamHI DNA 절편내에 존재하며 이 절편을 pUC13 벡터에 클로닝하였다. 플라스미드의 copy number와 gsh 유전자들을 포함하고 있는 삽입 DNA의 크기의 차이에 의한 gsh 유전자들의 발현 정도를 조사하기 위하여 pGH1090, pGH101, pGH200, pGH201, pLF4, pLF6 그리고 pGH300같은 여러 플라스미드를 사용함으로써 gshI 유전자의 발현이 의해 2배이상 증가하였다. 그러나 벡터 플라스미드내에 존재하는 gsh 유전자들을 포함하는 삽입 DNA의 크기의 차이에 의해서는 gsh 유전자들의 발현이 영향을 받지 않았다.