• 미생물학회지
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• 제48권2호
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• pp.109-115
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• 2012

Helicobacter pylori는 만성 위염, 소화성 궤양, 위암의 중요한 역학적 인자중 하나이다. H. pylori의 독성인자중 CagL은 숙주 세포와 H. pylori의 제 4형 분비기관(Type 4 secretion system)을 연결하는 adhesin으로 작용하는 섬모 단백질로 H. pylori가 발병하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이번 연구는 저빌에 H. pylori를 감염시킨 동물 모델을 이용하여 CagL 재조합 단백질을 면역화시켰을 때 나타나는 효과를 평가하였다. 재조합 CagL은 클론되었고, 과발현시켜 정제하여 준비하였다 저빌은 H. pylori 감염 대조군과 H. pylori 감염 CagL 재조합 단백질 접종군으로 분류하였고, 접종시 알루미늄 애쥬번트를 사용하였다. 일주일 간격으로 4회 근육내 접종하였고, 마지막 접종 일주일 후, 모든 저빌에 H. pylori 7.13 균주를 $1{\times}10^9\;bacteria/500{\mu}l$ 농도로 위내 투여하였다. H. pylori 감염 6주째 모든 저빌을 희생하여 혈청 IgG 반응평가를 위한 ELISA를 실시하였고, 위에서는 집락화된 H. pylori의 수평가, 병리조직학적 평가 및 사이토카인 유전자발현을 조사하였다. CagL 재조합 단백질접종 일주일 후부터 H. pylori 감염 CagL 재조합 단백질 접종군의 혈청내 IgG 항체형성이 유의적으로 증가하였다. 위에서의 집락화된 세균수는 두군의 차이가 없었다. 저빌 체중에 대한 위무게 비율는 H. pylori 감염 CagL 재조합 단백질 접종군이 유의적으로 감소하였으나 병리조직학적 평가에서는 유의적인 차이는 확인하지 못하였다. 위에서의 IL-$1{\beta}$와 KC (IL-8 homologues)의 유전자발현 정도도 두 군사이에 유의적인 차이는 없었다. 이번 결과는 CagL 재조합 단백질의 접종은 IgG 항체형성은 효과적으로 자극하였지만 면역화된 숙주에서 세균 집락화의 감소 및 병변형성의 방어까지는 유도하지 못한 것으로 나타났으며, 앞으로 H. pylori 감염에 대해 유효한 면역 반응 및 질병 방어 효과를 나타내기 위해서 CagL을 포함한 다른 종류의 재조합 항원 사용 및 보조적으로 전신 면역 및 점막 면역을 효과적으로 유도하기 위해 안정성있는 애쥬번트의 사용을 고려해야 할 것으로 사료된다.

• 대한수의학회지
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• 제36권3호
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• pp.665-680
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• 1996

Bovine Pneumonic Pasteurellosis는 수송열(輸送熱)로 일반적으로 알려져 있는 질병으로서, 여러가지 요인의 복합적(複合的)인 작용에 의해 발병하는 것으로 알려져 있으나, Pasteurella haemolytica A1이 가장 주요(主要)한 인자(因子)로 밝혀져 있다. P haemolytica A1은 leukotoxin(LKT), lipopolysaccharide(LPS), capsular polysaccharide 등 여러가지의 병원성인자(病原性因子)을 생성한다. 이들 인자중 LKT가 가장 중요한 병원성인자로 밝혀져 있다. 이에 본 실험은 P haemolytical A1의 LKT 유전자를 Bacillus subtilis에서 발현(發現)시킴으로서 LPS에 오염(汚染)되지 않은 LKT을 대량으로 생산할 목적으로 실시되었다. 실험의 첫 단계(段階)로서 pLKT52 plasmid을 Sau3 A1의 제한효소을 이용하여 부분소화(部分消化)시킨 후 이 부분 소화(消化)된 유전자들로부터 3~5kb 크기의 유전자들을 순수분리하여 pUC18와 결합시킨 후 E coli NM522에 형질전환(形質轉換)시켰다. 이때 형질전환된 균주들은 LKT에 대한 단크론 항체인 MAb601을 이용하여 colony blot 법에 의해서 LKT 유전자 보유 및 발현여부(發現與否)을 조사하였다. 이들 양성 clone들은 제한효소분석(制限酵素分析), 염기서열분석(鹽基序列分析) 및 Western blot 등에 의해서 재확인(再確認)하였다. 총 9개의 양성 clone중 위의 방법에 의해서 한 clone을 선택(選擇)하여 lktCA insert를 재분리하여 shuttle vector에 subcloning 하였다. Subcloning된 LKT 유전자들은 shuttle vector의 종류(種類)(pHPS9, p602/20, pHPS9-Sac)와 각기(各其) 다른 종류(種類)의 B subtilis(spoO12A, BR121, WB3O, Raj1105) 숙주내(宿主內)에서 발현정도를 Western blot 법에 의해서 비교(比較)하였다. 이때 최적발현조건(最適發現條件)은 p602/20와 pBL1의 dual plasmid system을 이용하여 B subtilis spoO12A에서 2시간동안 IPTG로 발현을 유도(誘導)하는 것이었다. B subtilis에서 발현된 LKT을 visual 법과 neutral red uptake 법을 이용하여 소 폐포(肺胞) 대식구(大食求)에 대한 biological activity를 확인하였다. 발현된 LKT에 대한 LPS 오염은 LKT을 SDS-PAGE 후 silver stain에 의해서 확인하였다. 본 실험을 통해서 볼 때에 lktCA 유전자를 보유(保有)하고 있는 p602/20는 B subtilis에서 매우 불안정(不安定)하였고, 발현된 LKT는 세균자체(細菌自體)에서 생성되는 protease들에 의해서 파괴(破壞)됨으로서 농도(濃度)가 매우 낮았다. 이러한 문제점들은 다음 단계(段階)의 실험에서 해결되어야할 문제들이다.

• Journal of Dairy Science and Biotechnology
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• 제36권4호
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• pp.208-219
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• 2018

낙농업 및 유가공 제품의 생산과 유통에서 살모넬라 감염에 의한 살모넬라증의 발생은 빈번하며, 이 세균의 항미생물 제제에 대한 내성 증가 현상 또한 지속되고 있어 새로운 항미생물 제제의 수요는 감소하지 않는다. 세균막의 훼손은 세균 생존을 쉽게 위협할 수 있기 때문에 개발되는 항미생물 제제들은 주로 세균의 막을 표적으로 삼지만, 개발되는 제제들이 실제로 세균막의 훼손을 초래하는지 구별하는 것은 많은 노력과 비용을 수반한다. 본 연구에서는 E. coli 세포막 스트레스에 의해 발현이 유도되고, 세균막 외부공간에서만 위치하며, 그 구조상 많은 단백질의 구조 안정화에 기여할 것으로 예상되는 chaperone 단백질 Spy(spheroplast protein Y)의 유전자에 상응하는 살모넬라 spy 유전자에 gfp(green fluorescence protein) 오페론 융합체를 제조하여, 이 융합체가 Salmonella enterica의 두 혈청형 Enteritidis와 Gallinarum의 세포막 스트레스를 인지하여 GFP 발현량이 크게 증가하는 것을 확인하였다. 또한 세균막 스트레스 신호를 특이적으로 인지하는 이인자 신호전달 체계(two component signal transduction system)인 Bae와 Cpx들이 두 살모넬라 혈청형의 spy 유전자 전사 유도에 필수적임을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 사용한 spy-gfp 오페론 융합체는 S. Enteritidis와 S. Gallinarum의 세포막 훼손을 특이적이고 신속하게 인식하는 biosensor로서 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

• 생명과학회지
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• 제31권3호
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• pp.356-365
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• 2021

최근, 본 연구진은 담수 환경 유래 한천 분해 세균인 Cellvibrio sp KY-GH-1 (KCTC13629BP)의 전체 유전체 염기 서열을 분석하여 아가로오스를 L-AHG 및 D-갈락토오스로 가수분해시키는 아가레이즈들을 암호화하는 유전 정보를 탐색하였다. 그 결과, KY-GH-1 균주는 유전체 상의 약 77 kb 길이의 아가레이즈 유전자 클러스터 내에 9개의 β-아가레이즈 유전자들과 2개의 α-네오아가로비오스 가수분해효소(α-NABH) 유전자들을 지닌 것으로 나타났다. 이러한 유전자 정보를 바탕으로 KY-GH-1 균주가 한천을 탄소원으로 자화하기 위해 단량체인 L-AHG와 D-갈락토오스로 분해시키는 공정은, 엔도형 GH16 β-아가레이즈, 엔도형 GH86 β-아가레이즈 등에 의해 개시되어 NA4, NA6, NA8 등을 생성시킨 후, 이들에 대해 엑소형 GH50 β-아가레이즈가 추가로 작용하여 NA2를 생성시키고, 이어서 GH117 α-NABH가 작용하여 생성된 NA2를 단량체 L-AHG와 D-갈락토오스로 분해함으로써 종결되는 것으로 예측되었다. 대장균 발현 시스템과 PET-30a 벡터를 함께 사용하여, KY-GH-1 균주 유래의 GH50 패밀리 β-아가레이즈 유전자들(GH50A, GH50B, GH50C)과 GH117 패밀리 α-NABH 유전자들(GH117A α-NABH, GH117B α- NABH)을 발현시켜 His-태그 재조합 효소단백질들로 확보하여, 이들 효소단백질을 이용하여 효소 활성을 비교 분석한 결과, 재조합 GH50A β-아가레이즈가 세 개의 GH50A 패밀리 β-아가레이즈 동위효소들 중에서 가장 높은 엑소형 β-아가레이즈 활성을 나타내며, 또한 재조합 GH117A α-NABH가 NA2를 L-AHG와 D-갈락토오스로 강력하게 가수분해할 수 있으나 재조합 GH117B α-NABH는 NA2 가수분해 활성이 없음을 확인하였다. 연이어 GH50A β-아가레이즈 및 GH117A α-NABH의 효소 특성을 추가로 조사하였다. 아울러 이들 각 효소가 나타내는, 아가로오스를 분해하여 NA2를 생성시키는 효율성과 NA2를 분해하여 L-AHG 및 D-갈락토오스를 생성시키는 효율성을 평가하였다. 본 총설에서는, L-AHG 및 D-갈락토오스의 양산을 위한 아가로오스의 효소적 가수분해에 성공적으로 활용될 수 있을 것으로 기대되는, 담수 유래 한천 분해 세균 Cellvibrio sp. KY-GH-1 유래의 재조합 GH50A β-아가레이즈 및 GH117A α-NABH의 장점들에 대해 기술한다.