The present studies were undertaken to examine the activitites of PKC isoforms in cultures of chick limb mesenchvme. Micromass cultures were prepared using wing buds of stage 23/24 (Hamburger and Hamilton, 19511 chick embryo. The cells were homogenized and DEAE-cellulose column chromatography was performed to get fraction containing protein kinase C (PKC) activity. PKC isoforms were resolved with hvdroxyapatitie column chromatography. Profile of PKC isoforms of cultures were compared with that of rat brain. Activity of $PKC-\beta$ isoform was appeared at the early stage of chondrogenesis. On 3 daw of culture, activities of both PKC a and $\beta$ were observed with remarkable increase but no activity of y isoform was appeared. Treatment of phorbol-12-mvristate-13-acetate (PMA) (10-7 M) to the culture inhibited chondrosenesis and down-regulated a and $\beta$ isoforms. Staurosporine promoted chondro!genesis without any effect on PKC isioforms profile. These data indicate that PKC a and $\beta,$ especiallv $\beta$ isoform is related to chondrosenesis and the promoting effect of staurosporine on chondrogenesis is not related to PKC isoforms activities.
Exo-polysaccharide (BWS) obtained from submerged cultivation of Ganoderma lucidum mycelium was fractionated. Antitumor activity of their fractions was investigated in comparison with the mycelial polysaccharide fractions. Eight kinds (BWS-DN, BWS-DA, BWS-DN-GI, BWS- DA-GI, MWS-DN, MWS-DA, MWS-DN-GI and MWS-DA-GI) of polysaccharide fractions were obtained by DEAE-cellulose ion exchange chromatography and Sepharose CL-4B gel chromatography from BWS and MWS, which were isolated from culture fiuid and mycelial cell, respectively. The anticomplementary activities (ITCH$_{50}$%) of the exo-polysaccharide fractions showing 15% to 30% were lower than those of mycelial polysaccharide fractions showing 15% to 70%. The acidic fractions of BWS-DA and BWS-DA-GI fractionated from BWS, showed the highest activity of 30%. In the MTT assay, BWS-DN and MWS against mouse leukemia L1210 exhibited high inhibition ratio of 86 and 89%, respectively at the concentration of 600 $\mu$g/ml. High inhibition ratio of 50% (IC$_{50}$) was achieved for BWS, BWS-DA and MWS-DA fractions against human colon adenocarcinoma COLO-205 and for BWS-DA, BWS-DN and MWS-DN fractions against human leukemia HL-60 at the concentra- tion of 300 $\mu$g/ml among the six polysaccharide fractions, respectively.
To find pharmacologically active components of Agrocybe cylin(Iracea, its basidiocarps were extracted with water. The extracts were separated by DEAE cellulose column chromatography, Sepharose CL-4B gel filtration, and Concanavalin A-Sepharose 4B affinity chromatography. Among the obtained fractions from A, cylinclracea, fraction IN which was the neutral proteinbound-polysaccharide fraction exhibited a marked antitumor activity and it was tentatively named "Cylindan". It showed about 70% of tumor inhibition against the solid form of sarcoma 180 when a dose of 30 mg/kg/day was intraperitoneally injected into ICR mice. When each fraction was examined by chemical analysis, Cylindan consisted of 85% polysaccharide, 3% protein and 1% hexosamine. Its polysaccharide moiety contained glucose, mannose, fucose and galactose and its protein moiety contained the comparatively large amounts of aspartic acid and glycine, and other 11 amino acids.
토양으로부터 분리한 Streptomyces sp. YSA-130으로부터 활성이 좋은 결정화된 alkaline protease를 분리하였다. Alkaline protease 생산의 최적 배양조건은 2.0% soluble starch, 1.0% soytone, 0.3% $K_2$HPO$_4$, 0.02% MgSO$_4$.7$H_2O$, 0.8% $Na_2$CO$_3$ 3$0^{\circ}C$, pH 10.5에서 72 시간 배양하였을 때 였다. Alkaline protease이 정제는 (NH$_4$)$_2$SO$_4$. 분별침전, 투석, DEAE cellulose column chromatography, Sephadex G-75 gel filtration, crystallization으로 하였으며, 그 결과 비활성도 14,290unit/mg, 정제도 23.8 배였고, 수율은 20.0% 이었다. Alkaline protease의 반응 최적온도와 pH는 6$0^{\circ}C$ 와 11.5이었으며, 효소의 pH 안정성은 5.5-12.0에서 안정하였고, 온도 안정성은 5$0^{\circ}C$까지 안정하였으며, $Ca^{++}$ ion 첨가시 6$0^{\circ}C$까지 안정성이 증가하였다. Alkaline protease의 분자량은 30,000이었으며 금속이온, EDTA, 환원제는 활성에 영향이 없었고 DFP에 의해 저해되었다. 계면활성제에 저항성이 크고 $H_2O$$_2$에 대한 잔존활성은 60% 을 유지하였다.
Cyclodextrin glucanotransferase(CGTase)를 생성하는 Bacillus sp. 균주를 토양으로부터 분리하였으며, CGTase 생성을 위하여 0.1% albumin, 2% $NH_4Cl$, 2% soluble starch, 0.2% $NH_2PO_4$를 효소생산배지에 첨가하여 $37^{\circ}C$에서 72시간 배양 시 최대의 활성을 나타내었다. Sephadex G-100과 G-150을 사용한 gel filtration과 DEAE-cellulose를 이용한 이온 교환 크로마토그래피로 9.72배 정제하였으며, specific activity는 528.02 unit/mg이었다. CGTase의 효소학적 특성은 최적 pH, 최적 온도는 pH 8.0과 $80^{\circ}C$였으며, pH $8.0{\sim}11.0$과 $60{\sim}80^{\circ}C$에서 안정하였다. 금속이온 중 $Pb^{2+},\;Hg^{2+}$와 $Zn^{2+}$에서 효소활성이 억제되었다. CGTase의 첨가 효소량을 $20.5{\sim}410$ unit 까지 변화시키며 stevioside로의 당전이능을 조사한 결과 20.5 unit 및 41 unit 처리 시 당전이율은 74.9%와 75,7%로 높게 나타났으며, 205 unit 처리시에는 당전이율은 68.7%로 비슷하였으나 갈변화가 진행되었다. 효소의 농도를 높여 410 unit를 처리했을 때 당전이율은 57.9%로 더욱 떨어졌으며 역시 갈변화가 진행되어 제품의 물성을 나쁘게 하였고, 당전이 산물 중 pentaglycoside와 hexaglycoside가 검출되지 않아 필요이상의 효소사용량은 오히려 당전이 반응에 역효과가 나타났다.
Bacillus subtilis HP-4의 ${\beta}-galactosidase$를 추출, 정제하여 효소의 고정화조건 및 고정화 효소의 특성을 조사하였다. B. subtilis를 배양하여 얻은 조효소액을 acetone분획 DEAE-cellulose에 의한 ion exchange chromatography, Sephadex G-100에 의한 gel filtration과정을 통하여 정제하였던 바 약 68% 정제되었으며, 이때의 회수율은 19.9%이었다. 본 효소의 최적 고정화조건은 2%(w/v)의 sodium alginate농도, 15%(v/v)의 효소농도, 그리고 2%,(w/v)의 $CaCl_2$ 농도에서 2시간 교반하였을 때 이었다. 고정화 효소의 최적온도와 pH값은 각각 $55^{\circ}C$와 6.5이었다. 고정화 효소의 활성은 Hg이온과 Cu이온에 의하여 저해되었으며, EDTA, 2-mercaptoethanol, KCN 등의 금속이온 그리고 보호제에 의한 영향은 없었다. 고정화 효소의 ONPG와 유당에 대한 $K_m$값과 $V_{max}$값은 각각 $1.82{\times}10^{-2}M$과 $2.94{\times}10^{-2}M$ 그리고 $3.57{\times}10^{-8}mole/min$과 $1.68{\times}10^{-7}mole/min$이었다. 고정화 효소를 $4^{\circ}C$에서 40일간 저장 후 잔존활성과 5회 재사용 후 잔존활성을 조사한 결과는 각각 95%와 81%이었으며, 탈지유(4.8% 유당)와 5% 유당용액에서 $50^{\circ}C$, 9시간 반응시켰을 때 유당분해율은 각각 51%와 43%이었다.
L- $\alpha$ -glycerophosphate oxidase(GPO)는 L- $\alpha$-glycero-phosphate를 산화시켜 dihydroxyacetone phosphate와 과산화수소의 생성을 촉매시켜 주는 효소로서 혈중에 존재하는 triglyceride의 양을 측정하는 kit를 개발하는데 이용할 수 있으며 본 연구 결과로 종균을 개발 및 확보하였으며, 이 종균의 사용으로 GPO의 발효공정기술을 확립하였고, 또한 이들 조효소로부터 순수한 효소를 생산할 수 있는 정제공정 기술을 확립하였다. 먼저 ATCC에서 네 가지 균주와 KCTC에서 세 가지 균주, 그리고 본 연구실에서 분리한 Streptococcus faecium $M_{74}$.LC 균주 등 8가지 균주의 성장상태를 비교하고 GPO의 역가를 측정 해 본 결과, 배양액 1 L당 ATCC 19634는 65 units, ATCC 12755는 60 units, S. faecium $M_{74}$. LC는 67 units로 S. faecium $M_{74}$.LC가 제일 높은 역가를 생산하였다. 또한 발효조에서 배지의 양을 3 L로 하여 배양온도는 $37^{\circ}C$, 교반속도는 300 rpm, 통기량은 0.5 L/min, 17시간 배양하였을 때 가장 많은 양의 균체가 생성되었으며, GPO의 생산량도 가장 많았다(256 units/L). 이 때 배지 조성은 glucose 0.1%, glycerol 0.2%, tryptone 1.0%, yeast extract 1.0% 및 $K_2HP0_4$0.5%로 하여 배양하였고 GPO의 정제공정은 염투석 분획과 이온 교환수지 공정으로 대별할 수 있으며, 이온교환수지는 DEAE-cellulose 칼럼을 이용한 정제수율은 약 47%를 얻을수 있었다.
국내산 갈조류로부터 생리 기능성이 우수한 수용성 식이섬유 소재를 개발하기 위한 기초자료를 얻기위해 다시마와 미역(엽상체와 포자엽 각각)으로부터 fucoidan을 추출, 정제하여 그 특성을 조사하였다 Fucoidan의 추출 조건은 pH 2.0의 산성 추출액으로 $65^{\circ}C$I에서 1시간 씩 3회 추출을 하였고 cetylpyridinium chloride를 사용하여 부분 정제하였다. 부분 정제 fucoidan의 수율은 다시마 $2.71\%$, 미역포자엽 $6.65\%$, 미역 엽상체$0.40\%$였다. 특히 미역포자엽의 수율이 가장 높은 반면에 미역 엽상체는 가장 낮아 부위에 따른 차이가 매우 큼을 알 수 있었다. DEAE-Sephadex A-25 이온 교환 칼럼으로 부분 정제 fucoidan을 분획한 결과 다시마, 미역포자엽 모두 3종의 fraction으로 분획되었고 각 fraction은 전기 영동상에서 2종 이상의 band가 검출되어 불균일함을 알 수 있었다 이온 교환 칼럼으로 분획한 주fraction을 다시 알콜 분별 침전법으로 재분획한 결과 다시마와 미역포자엽은 에탄올농도 $60-70\%$에서 침전된 fraction이 cellulose acetate 전기 영동 및 gel filteration chromatography상에서 균일성을 나타내었다. 균일하게 정제된 fucoidan의 fucose : galactose : 황산기의 mole 조성비는 다시마, 미역포자엽이 각각 1 : 0.31 : 2.43,1 : 0.87 : 1.99였다. 분자량은 다시마가 31,000, 미역포자엽이 38,000으로 비교적 적었다.
담자균류인 좀우단버섯 Paxillus atrotomentosus의 항암성분을 구명하기 위하여 그 균사체를 열수 추출하여 단백 다당체를 분리하였고, 이를 DEAE-cellulose ion 교환수지와 Sepharose CL-4B gel filtration chromatography로 정제하였다. 분획들을 각각 20 또는 50 mg/kg/day의 용량으로 마우스의 복강내에 투여하였을 때, sarcoma 180 고형암에 대하여 Fr. A가 68.51%의 가장 높은 억제율을 나타내었다. 항암기전을 밝히기 위하여 마우스에 대한 면역학적 실험을 한 결과, Fr. A는 대조군에 비해 활성화된 macrophage에서 분비되는 superoxide anion 양을 1.1배, hemolytic plaque assay에서의 용혈반 형성 세포수를 2.3배 증가시켰고 감소된 DTH 반응을 정상수준으로 회복시켰다. 암세포에 대한 직접적인 영향을 조사하기 위하여 MTT assay를 한 결과 대조군에 비해 세포의 viability가 약 32% 감소됨을 나타내었다. 화학분석에 의해, 이 성분은 fucose, galactose, glucose, mannose 및 xylose로 구성된 86.36%의 다당체와 14종의 아미노산으로 구성된 1.52%의 단백질 및 1.64% hexosamine으로 구성된 protein-bound polysaccharide이었다. 이 성분을 paxillan으로 명명한다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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