녹두의 자엽에서 peroxidase isozyme을 $(NH_4)_2SO_4$ 침전, Sephadex G-75, DEAE-cellulose 및 DEAE-Sephadex A-50 column chromatography 등으로 63배 정제하여 그 특성 및 결정구조를 조사하였다. Isozyme C는 Rm 값이 0.24로서 분자량이 50,000 dalton인 단량체였다. 이 효소의 반응 최적 PH는 o-dianisidine에 대하여 5.0, guaiacol에 대해서는 6.0, 반응 최적온도는 $70^{\circ}C$였으며 열에 대해서도 비교적 안정하였다. o-dianisidine과 guaiacol에 대한 Km 값은 각각 0.11mM, 60.98mM이었으며, isozyme C에 대한 기질과 cyanide는 경쟁적 저해형식을 나타내었다. Isozyme C는 평면상 직사각형의 결정구조를 하고 있었다.
누룩으로부터 ${\beta}-galactosidase$ 활성을 가지는 균주를 순수분리하여 분리된 균주(NY-15)의 ${\beta}-galactosidase$를 정제하였다. 다량배양하여 모은 균체를 8%(v/v) toluene 처리에 의한 추출액을 정제의 출발 물질로 하여 acetone 침전에 의해서 탈지처리를 한 후 40-60%포화의 ammonium sulfate 분획을 하고 DEAE-cellulose, DEAE-Sephadex A-50의 이온교환 chromatography를 한 후 Agarose-PAPT를 이용한 affinity chromatography에 의해서 정제하였다. 이 정제법에 의해서 ${\beta}-galactosidase$는 조효소 추출액으로부터 40배 정제되었으며 회수율은 7.7%였나. 누룩 yeast의 ${\beta}-galactosidase$는 2개의 subunit로 되어 있으며, 각 subunit 분자량은 각각 96,000과 130,000이었다. 효소활성에의 최적 pH는 7.5이었고, 최적온도는 $40^{\circ}C$이었다.
Aspergillus sp.C-58 균주가 생산하는 extracellular inulase에 대하여 pH, charcoal처리 및 ammonium sulfate로 분별염석한 후 DEAE- cellulose를 이용한 column chromatography에 의하여 3개의 효소단백질(Peak I, II, III)로 분획되었으며 그 비율은 31. 1 : 1.7 : 1이였다. P- I, II의 I/S는 그 비율이 0.23 및 0.24로 거의 동일하였으나 P-III는 1.1로 P-I및 P-II와 상이하였다. Peak I 효소에 대하여 DEAE-Sephadex A-50을 이용한 ion exchange chromatography에 의하여 추출효소에 비교하여 약 408배 정제되었으며 다시 Sephadex G-75 및 Sephadex G-100에 2회 gel filtration하여 약 482배 정제되었다. 이상과 같이 정제한 Peak I의 효소액은 poly acrylamide를 이용한 disc gel electrophoresis 및 ultra centrifugation에 의하여 단일 단백질로 확인되었다.
Protein kinase C, a protein related in PI cascade, was partially purified from the cytosol protein of etiolated plants of Glycine max by DEAE-52 cellulose chromatography and phenylsepharose chromatography. When the DEAE column was eluted with 0-0.8 M linear gradient KCl, tow fractions were found that increased the phosphorylation of histon H1 about five and nine-fold in the presence of 5 $\mu\textrm{g}$/mL phosphatidylserine and 0.5 $\mu\textrm{g}$/mL diolein, respectively. These fractions were used as DEAE pool. The reaction eluted with relatively high concentration of KCl was loaded on phyenylsepharose column with 5 mM CaCl2 and eluted with 1 mM EGTA. A fraction contained the protein kinase C, which increased the phosphorylation of the histon H1 was fractionated. To determine the molecular weight of PKC, the fraction eluted from phenylsepharose column was analyzed by 5~15% polyacrylamide gel electrophoresis after concentrated with the Amicon membrane (YM10). That revealed two bands corresponding to 60 and 65 kGy by silver staining of the gel, respectively.
자연계에서 진균류와 절족동물의 외피를 이루는 주된 다당류인 chitin(N-acetyl glucosamine polymer)의 $\beta$-1, 4-lingkage를 가수분해하는 Strepto-myces sp. 115-5 균주로부터 생성되는 chitinase를 정제하여 그 성질을 조사하였다. 48시간 진탕배양하여 생성된 chitinase를 ammonium sulfate처리, 1차 Sephadex G-100, DEAE-Cellulose, 2차 Sephadex G-100 column chromatography하여 정제하였으며 그 순도를 CM-Sephadex C-50 column chromatography 및 polyacryla-mide gel electrophoresis로서 확인하였다. 이 chitinase는 chitin과 chitosan을 가수분해 할수 있었으나 cellulose는 분해할수 없었고 chitin을 기질로서 사용하였을 경우 Km value가 3.6mg/ml이며 Vmax가 100 $\mu$mole/hr였다. Activation energy는 산 가수분해보다 훨씬 낮은 3.66kca1/mole이었고 분자량은 Sephadex G-100을 사용한 column chromatography에서 56,000 daltons으로 나타났으며, 이 chitinase의 등전점은 pH3.0에서 보여졌다.
Bacillus cereus에 의한 pullulanase 생산의 최적 배양온도 및 배양시간은 각각 $15^{\circ}C$, 72시간이고, 기본배지에 casein, nutrient broth, egg albumin의 첨가는 효소의 생산을 크게 증가시켰다. 황산암모늄분획, CM-cellulose와 DEAE-cellulose column chromatography에 의하여 효소를 정제하였고 정제효소의 specific activity는 29.09U/mg protein, 수율은 17.1이었다. 정제효소는 polyacrylamide disc gel electrophoresis에 의하여 single band를 나타내었고, SDS-polyacrylamide disc gel electrophoresis에 의하여 추정된 분자량은 61,000, 등전점은 pH7.0, 최적온도는 $40^{\circ}C$, 최적 pH는 6.5, $35^{\circ}C$ 이하에서 안정하였고, pH 안정 범위는 6.5-11.0, $Ag^{+}$, $Hg^{2+}$, $Zn^{2+}$에 의하여 크게 저해되었고, $Ca^{2+}$은 효소의 내열성을 증가시켰다. 정제효소는 공시기질중 pullulan을 잘 분해시켰으며 pullulan에 대한 분해산물은 maltoriose이었다.
누에의 유충 체액내에 다량으로 존재하는 저분자 체액단백질(MHP)의 체액 내의 출현시기, 체내 생합성에 관하여 polyacrylamide gel 전기영동 및 autoradiography로 조사하고, 동시에 MHP의 b성분에 대한 분리.정제를 시도하였다. 얻어진 연구결과는 다음과 같다. 1. MHP의 a성분은 유충 4령 2일의 그리고 b와 c성분은 5령 1일의 체액에 각각 출현하기 시작하여 5령 2일 이후 급격한 농도의 증가를 보였다. 2. MHP의 b와 c성분은 유충 5령 초기의 지방체에서 생합성된 후 곧 체액에 방출되나 a성분의 정확한 합성장소와 시기는 불완전하다. 3. 토사기의 유충 체액을 열처리(6$0^{\circ}C$, 5분), gel 여과 및 DEAE-cellulose와 CM-cellulose chromatography법에 의해 분리.정제한 결과 순도가 거의 100%에 가까운 MHP-b를 얻었다.
수산가공공장에서 원료어 처리시 생성되는 부산물인 참치 내장중 유문수 조직으로부터 높은 활성을 가진 단백질 분해효소를 추출하고, 이것을 부분 정제하여 참치 유문수 유래 조효소(TPCCE)를 대량으로 제조하였다. 제조된 TP-CCE에 대한 최적활성조건을 규명하였으며, 아울러 시판 정제 단백질 분해효소들과 비교하였다. 또한 TPCCE의 열안정성을 높이고자 몇가지 종류의 담체에 물리적으로 흡착시켜 제조한 고정화 효소의 열안정성을 검토하였다. 1. 참치 유문수 조직으로부터 높은 활성을 가진 단백질 가수분해효소를 부분정제하여 조효소 상태를 추출하였으며 이때의 수율은 약 2.7% 정도로 매우 높았다. 활성은 천연기질인 카제인에 대하여 0.54 U/mg이었고, 합성기질인 BTEE와 BAEE에서는 각각 1.10과 2.69 U/mg로서 시판정제효소인 trypsin과 유사한 활성을 나타내었다. 2. 참치유문수 유래 조효소의 천연기질인 casein에 대한 가수분해의 최적조건은 pH 10.0, 반응온도 45$^{\circ}C$, 반응시간 12시간이었으며, 이 때의 가수분해도는 약 80%였다. 3. 참치 유문수로부터 추출된 조효소를 여러 가지 담체에 고정화시켰으며 이용된 담체중에서 고정화율은 Chitopearl, DEAE-Cellulose 및 키틴 순으로 가장 높았으며(70~80%), 합성기질인 BAEE에 대한 활성은 키틴, DEAE-Cellu-lose 및 키토산 고정화 효소의 순서로 각각 2.46 U/mg, 2.35U/mg, 및 2.29 U/mg이었고, BTEE에 대한 활성은 키토산, 키틴, CM-Cellulose의 순서로 각각 0.89 U/mg, 0.88 U/mg 및 0.86 U/mg이였다. 이중 키틴 고정화 효소가 모든 조건에서 충분한 효과를 보여 가장 효율적으로 나타났다. 4. 고정화 효소의 열안정성에서 대부분의 고정화 효소는 유리 TPCCE보다 높은 열안정을 보였으며, 특히 DEAE-Ce-llulose를 이용한 고정화 효소는 6$0^{\circ}C$의 높은 온도에서 7일이 경과한 후에도 약 95%의 활성을 유지하여 장시간의 효소 반응공정이나 고정화 효소를 이용한 컬럼 반응에서의 연속적 단백질 가수분해물 생성과 같은 공정에서 매우 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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