세포막 정보전달 경로에서 수용체에 전달된 정보를 세포내로 전달하는데 조절 단백질로 알려진 GTP 결합단백질을 소외 뇌조직으로부터 정제하고 그 분자량등을 관찰하였다. 분쇄한 소의 뇌조직으로부터 세포막을 분리 해내고 1% cholate를 이용하여 세포막 단백질을 얻었으며 DEAE-Sephacel column chromatography를 시행하였다. 여기서 얻은 GTP 결합단백질은 다시 Ultrogel AcA 34 column chromatography, heptylamine-Sepharose column chromatography 순으로 실시하여 $GTP{\gamma}S$와 결합하는 단백질 분획을 모았고 활성도와 일치하는 분획을 얻었다. 전기영동으로 관찰한 결과 $Go{\alpha}$가 분자량 39,000 dalton. $G{\beta}$가 36,000 dalton인 band를 확인하였고 나머지 다른 단백질도 함께 관찰되어 heptylamine-Sepharose 분획을 다시 DEAE-Sephacel column에 적용하여 순수한 band를 구하였다. GTP 결합단백질의 활성화는 GTP가 결합될 때 ${\alpha}$부분과 결합하고 ${\beta}{\gamma}$는 떨어져 나간다. 그러므로 heptylamine-Sepharose column분획의 활성도에서 $Go{\alpha}$의 band 분획과 곡선의 활성도가 일치하고 ${\beta}$는 곡선이 하향하는 분획에서 전기영동상에 관찰되었다.
콩나물 줄기로부터 추출, 정제한 peroxidase는 glucose oxidase와 함께 guaiacol을 기질로 사용하여 포도당의 분석에 사용되었다. peroxidase는 DEAE-Sephacel ion exchange column chromatography를 통해 얻은 분획이 조효소액에 비해 specific activity가 10.8배 증가되었고 수율은 11.3%였다. 정제된 peroxidase와 glucose oxidase를 이용한 포도당 분석의 최적 pH는 5.5였고 최적온도는 $40^{\circ}C$로 나타났으며 포도당 양의 증가에 따라 효소활성은 증가되었으며 반응시간과의 관계에서도 직선을 보여 주었다. 그리고 L-cysteine과 dithiothreitol과 같은 환원제는 포도당 분석에 이용되는 glucose oxidase와 콩나물 peroxidase의 활성을 저해하는 것으로 나타났다.
한국응용약물학회 1998년도 Proceedings of UNESCO-internetwork Cooperative Regional Seminar and Workshop on Bioassay Guided Isolation of Bioactive Substances from Natural Products and Microbial Products
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pp.161-161
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1998
To achieve the aim of this investigation, the extracellular protease was isolated from bacteria BAC-4, a strain was cultivated in the medium for the production of penicillin acilase in a period of 32 hours. The enzyme was first purified by aceton precipitation method, followed by ion exchange chromatography on DEAE-sephacel column. The highest specific activity of the aceton fraction was found to be 2.19 unit per mg, with degree of purification of 13 times. Further purification of the enzyme on DEAE -sephacel had a specific activity of 58.6 unit per mg and degree of purification of 344 times compared to its crude extract. The optimum pH of the enzyme was 8.4, and the potimum temparature was 37$^{\circ}C$. The K$\_$M/ and $V_{max}$ calculated at experiment conditions were found to be 0.66%(W/V) and 3.61 unit per mL respectively.
Multiple forms of extracellular phospholipase $A_2$ have been detected in human amniotic fluid (HAF). When HAF was subjected to heparin-Sepharose column chromatography, phospholipase $A_2$ activity was detected in both heparin-non binding and binding fraction. The activity of heparin-non binding fraction was further purified by sequential uses of column chromatographies on butyl-Toy-opearl 650M and DEAE-Sephacel. DEAE-Sephacel fraction contained three different phospholipase $A_2$ activities (Peak I, II, III). The molecular weight of DEAE-Sephacel fraction phospholipase $A_2$ determined by SDS-PAGE were about 52KDa (Peak I). Peak II, III required micromolar $Ca^{2+}$ ion for its maximum activity, but Peak I enzyme showed calcium independent phospholipase $A_2$ activity and showed broad range of pH (6.0~10.0) optimum. All these enzymes were not recognized by a monoclonal antibody raised against phospholipase $A_2$ from human synovial fluid. These results suggest that HAF might contain multiple forms of extracellular phospholipase $A_2$, which may neither belong to the 14KDa group II phospholipase $A_2$ family nor cytosolic phospholipase $A_2$.
Thiobacillus thiooxidans KCTC2505에서 메칠머캅탄(MM) 가스를 기질로 메칠머캅탄 산화효소(MMO)를 유도할 수 있었으며 DEAE-Sephacel과 Superose 12 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 이때 얻어진 각 효소의 비활성은 각각 19.7과 80.1 units/mg-protein이었으며 효소의 최적 온도는 $43^{\circ}C$였다. 상기 정제된 효소액은 SDS-PAGE상에서 68.1 kDa의 분자량을 가진다. 이 효소는 암모늄염의 존재하에서는 활성이 증가하였으나 KCl 존재하에서는 감소하였으며 NaCl에 대해서는 거의 영향을 받지 않는 특성을 가지고 있다. 에탄올, 메탄올, 글리세린의 첨가에 대해 효소활성은 부분적으로 불활성화되었으며 아세톤의 경우에는 완전히 저해되었다. Purpald 발색법을 이용한 흡광도의 변화는 구강내 존재하는 MM 가스로부터 생성될 수 있는 수 십 nmol의 범위의 포름알데하이드에 대해 눈으로 인지가능한 발색시스템에 사용할 수 있음을 확인하였다.
Aspergillus sp.로부터 추출한 glucoamylase를 Sephacryl S-200과 DEAE-Sephacel 이온교환 칼럼을 통과시킨 후, 2개의 Isozyme으로 분리하였다. 분리된 glucoamylase isozyme(GI, GII)의 효소학적특성을 각각 조사하였다. GI 및 GII isozyme의 활성최적 pH 및 온도는 pH4.5 및 $65^{\circ}C$였다. 분리된 효소는 pH 3-7 사이에서 안정했으며, 또한 55$^{\circ}C$ 이하에서 안정하였다. Hg$^{++}$는 효소 황성을 완전히 저해하였으나, 글리세롤은 효소의 안정성을 크게 증가시켰다. 효소반응의 활성화에너지는 GI의 경우 10,62 kcal/mole이었으며, GII의 경우에는 10.23kcal/mole이었다. GI isozyme의 기질에 대한 Km값은, 0.62% (soluble starch), 0.32% (dextrin), 1.03%(glycogen)이었으며, GII isozyme의 경우에는, 0.66%(soluble starch) 0.23%(dextrin), 그리고 0.14% (glycogen)이었다.
Purification of the isocitrate lyase extracted from Microbacterium laevaniformans was investigated. The isocitrate lyase was purified 43.6 folds by the following continuous treatment with ammonium sulfate fraction, DEAE-cellulose, DEAE-sephacel and Sephadex G-200 chromatography. The purified isocitrate lyase was showed to be a single protein band by polyacrylamide gel electrophoresis. The molecular weight of the purified isocitrate lyase was estimated 54,000 Da by the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The Km and Vmax values for isocitrate were estimated to be 0.83mM and 0.33units/ml, respectively. Activity of isocitrate lyase was inhibited by cystein-HCl and glutathione.
Thiobacillus thioparus TK-m에서 메칠머캅탄(MM) 가스를 기질로 메칠머캅탄 산화효소(MMO)를 유도할 수 있었으며 DEAE-Sephacel과 Superose 12 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 이때 얻어진 각 효소의 비활성은 각각 374과 1240.8 units/mg-protein이었으며 효소의 최적 온도는 $55\;^{circ}C$였다. 상기 정제된 효소액은 SDS-PAGE상에서 66.1 kDa의 분자량을 가지며 20 mM $(NH_4)_2SO_4$ 혹은 200 mM NaCl의 첨가에 대해 최대 활성을 보였다. 글리세린, 에탄올, 아세톤의 첨가에 대해 효소활성은 부분적으로 불활성화되었으며 메탄올에 대해서는 저해받지 않았다. Purpald 발색법을 이용한 흡광도의 변화는 구강내 존재하는 MM 가스로부터 생성될 수 있는 수 십 nmol의 범위의 포름알데하이드에 대해 눈으로 인지가능한 발색시스템에 사용할 수 있음을 확인하였다.
Aspergillus niger로부터 acidic nucleotidase를 Sepharose CL-6B gel 여과와 DEAE-Sephacel 이온교환수지를 이용하여 부분정제하였다. 5'-AMP 와 3'-AMP를 기질로 사용했을 경우에 효소의 최적 pH는 4.5, 그리고 최적온도는 $55^{\circ}C$였다. 그러나, p-nitrophenyl phosphate를 기질로 사용했을 경우에는 최적 pH는 변화가 없었으나, 최적 온도는 $70^{\circ}C$였다. 효소의 활성화에너지는 3'-AMP, 5'-AMP 그리고 p-nitrophenyl phosphate를 기질로 사용했을 경우에 각각 4.76kcal/mole, 6.95kcal/mole 그리고 11.82kcal/mole 였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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