• 제목/요약/키워드: Coomassie Brilliant Blue R

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Fast Protein Staining in Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel using Counter ion-Dyes, Coomassie Brilliant Blue R-250 and Neutral Red

  • Choi, Jung-Kap;Yoo, Gyurng-Soo
    • Archives of Pharmacal Research
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    • 제25권5호
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    • pp.704-708
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    • 2002
  • A fast and sensitive protein staining method in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) using both an acidic dye, Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBBR) and a basic dye, Neutral Red (NR) is described. It is based on a counter ion-dye staining technique that employs oppositely charged two dyes to form an ion-pair complex. The selective binding of the free dye molecules to proteins in an acidic solution enhances the staining effect of CBBR on protein bands, and also reduces gel background. It is a rapid staining procedure, involving fixing and staining steps with short destaining that are completed in about 1 h. As the result, it showed two to fourfold increase in sensitivity comparing with CBBR staining. The stained protein bands can be visualized at the same time of staining.

Coomassie brilliant blue G 및 R을 이용한 말 정액 첨체 염색 기법 (Acrosome staining with Coomassie brilliant blue G or R on the horse spermatozoa)

  • 김성우;신상민;유연희;이재영;김찬란;고응규
    • 한국산학기술학회논문지
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    • 제21권9호
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    • pp.57-63
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    • 2020
  • 말 정자의 첨체 손상도를 간단하게 분석하는 기술을 개발하기 위하여 Coomassie brilliant blue G 또는 R 염색 시약을 이용하여 정자 도말 슬라이드에 대한 염색도를 조사하였고, 3.7% paraformaldehyde (PF)과 35% methanol (MT) 고정제가 첨체 염색에 미치는 영향을 연구하였다. PF로 고정한 후 말 정자 도말 슬라이드를 0.05, 0.1 및 0.2 % 농도 CBB에 각 2분간 염색을 실시하여 첨체를 관찰하면 0.05%의 경우 완전한 첨체 염색도가 G형에서 62.6%, R형은 61.5%로 관찰되었으나, 0.1 및 0.2%의 경우, 80.2 및 79.7%로 (G 형), 78.1 및 76.0%로 (R 형) 관찰되어 유의적 차이가 나타났다. 그러나 MT 고정제를 이용할 경우, 첨체 외막이 느슨해진 정자의 비율은 3.5%로 관찰되어 PF 고정제를 사용하면 9.0%로 관찰되어 유의적으로 낮게 관찰되었다. 이러한 결과는 말정자첨체손상도를 관찰하기 위하여 CBB G 또는 R형 염색시약을 0.1~0.2% 농도로 이용될 수 있음을 증명한다. 또한, 말 정자 슬라이드 도말을 고정하는데 있어 고정제의 선택이 중요하며 MT보다 PF를 활용하는 것이 첨체 변화 과정 중인 정자를 관찰하는데 중요하다는 보여 준다. 이러한 방법은 말의 인공수정을 위한 정액의 저온저장 또는 동결보존과정 중에서 정자첨체손상율을 정확하게 판별하는데 이용될 수 있음을 증명한다.

백색부후균 Phanerochaete chrysosporium에서 유래한 Manganese Peroxidase Gene(mnp5)의 Pichia pastoris에서의 이종발현 (Expression of a Manganese Peroxidase Gene (mnp5) from White rot fungus Phanerochaete chrysosporium in the Pichia pastoris)

  • 이재원;양인;五十嵐圭日子;鮫島正浩;최인규
    • Journal of the Korean Wood Science and Technology
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    • 제33권4호통권132호
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    • pp.45-52
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    • 2005
  • 백색부후균 Phanerochaete chrysosporium으로부터 유래한 Manganese peroxidase (mnp5)를 methylotrophic yeast인 Pichia pastoris에서 이종 발현을 하였다. 이종발현으로부터 얻어진 단백질은 클로닝으로부터 예상되어지는 분자량보다 높은 분자량인 45 kDa으로 나타났다. 이것은 mnp5가 가지고 있는 glycosylation site에 의한 것이며, N-linked hyperglycosylation이 효소 활성에 영향을 미치는지를 site direct mutation에 의해 확인하였다. Sodium dodesyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)와 Coomassie Brilliant Blue (CBB) 염색에 의해 분자량을 확인한 결과 약 37 kDa으로 나타났으며, 효소활성을 측정한 결과 glycosylation이 효소 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구로부터 P. pastoris에서 mnp5의 이종발현이 성공적으로 이루어졌으며 이러한 결과로부터 heme을 포함하고 있는 단백질의 이종발현 생산의 가능성을 보여주었다.

효소면역 전기영동 이적법을 이용한 질트리코모나스 항원의 비교 분석 (Comparative antigen analysis of yrichomonus vaginulis by enzyme-linked immunoelectrotransfer blot technique)

  • 민득영;임미혜
    • Parasites, Hosts and Diseases
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    • 제30권4호
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    • pp.323-328
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    • 1992
  • 질트리코모나스의 항원 분석을 시행하기 위하여 병원성이 화인된 질트리코모나스(Trichamonas vaginnlis) 6개주(HY-1,2,3,9,10,13)의 항일을 sodium dodecyl sulfate - polyacrlyamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) 한 결과 Coomassie brilliant blue 염색상에서 peptide의 밀도 차이를 제외하고는 주간에 동일한 단백질 분포양상을 보였으며, 12kDa에서 170kDa까지 약 35개 정도의 분획이 관찰되었다. 또한 질트리코모나스 HY월주를 항원으로 하고 질트리코모나스 6개주에 대해 면역된 마우스의 항혈청을 이용하여 enzyme-linked immunoelectrotransfer blot(EITB)을 시행한 결과 각 주마다 서로 다른 반응양상을 보였으며, 51kDa과 96kDa에서 질트리코모나스의 특이한 공통 반응대가 관찰되었고, 각기 다른 6개주의 항원에 대해 HY-1주의 항혈청으로 ETTB한 결과 HY-1 함원(homologous antigen)과의 반응 양상과 타항친(heterologous antigen)과의 반응 양상간의 특이한 차이는 관찰할 수 없었다. 이상의 결과로 보아 질트리코모나스 각 주의 항원은 항인-항체 반응에서 주간에 이종(antigenic heterogeneity)을 형성하고 있는 것으로 보였으며, 41, 47, 55, 74 및 94kDa에서 질트리코모나스애 특이한 공통반응대를 보었으며, 이 부분이 숙주-기생충의 상 호관계에 있어서 중요한 의의를 내포하고 있을 것으로 생각된다.

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Fertilizing Promoting Peptide와 Pentoxifylline으로 처리된 소와 사람 동결 정액의 수정능 향상 (Enhancement of Fertilizing Ability of Frozen-Thawed Bovine and Human Spermatozoa Treated with Fertilizing Promoting Peptide or Pentoxifylline)

  • Lee, K.S.;Kim, E.Y.;Park, S.Y.;Shin, H.A.;Park, S.P.;Lim, J.H.;Chung, K.S.;Lee, H.T.
    • 한국가축번식학회지
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    • 제25권4호
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    • pp.409-419
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    • 2001
  • 본 실험은 PF과 FPP가 소와 사람 동결 정자에 첨가되었을 때 응해 후 정자의 체외 생존성, 운동성 그리고 intact acrosome 향상에 기여할 수 있는지의 여부를 조사하고자 실시하였다. 사람의 정액은 TYB 동결 배양액을 사용하여 초 급속 동결하였다 PF과 FPP 첨가 효과는 각각의 시약이 동결-응해된 소나 사람 정자의 현미경적 조사에 의한 운동성에 미치는 영향과 Coomassie brilliant blue 염색방법에 의한 intact acrosome의 비율에 미치는 영향으로 조사하였다. Bovine 동결 응해 정자에 PF을 첨가하여 운동성을 조사하였던 바, 5 mM 처리군 (50.0%)이 대조군 (34.0%) 보다 유의하게 높은 운동성을 보여주었다 (F<0.05). 동결 응해된 소 정자에 FPP를 농도에 따라 처리하여 intact acrosome을 조사하였던 결과, 50 nM 치리춘 (49%)이 대조군과 25 nH 처리군 (30.0, 38.0%) 보다 유의하게 많은 intact한 acrosome을 유지하였다 (P<0.01). 사람 정자에서 동결에 앞서 PF을 농도에 따라 첨가하여 동결 응해 후 운동성을 조사한 결과, 5.0 mM 처리군 (51.0%)이 대조군과 2.5 mM (39.0, 40.0%) 처리군의 운동성보다 높았다 (P<0.01). 사람 정액의 모든 동결 처리과정 (동결전, 동결, 응해후)에서 50 nM (75.5%) FPP 첨가가 intact acrosome percentage 유지하는데 유의한 효과가 있었다 (대조군: 45.0; 25 nM: 53.0; 100 nM: 68.0%) (P<0.01). PF와 FPP 첨가하여 사람 정자의 동결융해 후 운동성과 intact acrosome에 미치는 영향을 동시에 비교해본 결과, 운동성에서는 PF 처리군이 약간 높지만 intact acrosome rate는 FPP 처리군의 결과 (65.0%)가 PF 처리군 (43.0%)보다 유의하게 높았다 (P<0.05). 따라서 본 실험은 동결-융해된 소 정자에 PF이나 FPP 첨가는 정자의 운동성이나 intact acrosome 비율을 좀더 개선시킬 수 있고, 특히 사람 정자는 동결 전 과정에 FPP를 첨가하는 것이 정자의 체외 생존성, 운동성 그리고 intact acrosome을 유의하게 향상시킬 수 있다는 것을 시사한다.

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TNT에 대한 세균의 반응기작: 생존율, 스트레스 유도단백질의 SDS-PAGE 및 2-D 전기영동 분석 (Responses of Bacteria to TNT: Cells′Survival, SDS-PAGE and 2-D Electrophoretic Analyses of Stress-Induced Proteins)

  • 오계헌;장효원;강형일;김승일
    • 미생물학회지
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    • 제38권2호
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    • pp.67-73
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    • 2002
  • 폭약 2,4,6-trinitrotoluene (TNT)스트레스 조건하에서 토양세균 Pseudomonas sp. HK-6의 세포반응에 대하여 조사하였다. 다양한 농도의 TNT에 노출됨으로서 약 70-kDa DnaK와 60-kDa GroEL의 스트레스 충격단백질 (stress shock proteins, SSPs)이 단떠질이 유도되었다. 이들 SSPs의 존재는 SDS-PAGE과 anti-DnaK와 anti-GroEL monoclonal antibodies를 이용한 Western bolt을 통하여 확인되었다. SSPs은 0.5 mM TNT로 6-12 시간 처리된 세포에서 나타났으며, TNT에 노출 후8시간대 에서 최대의 단백질 유도가 관찰되었다. $30^{\circ}C$에서 $42^{\circ}C$로 열변환충격을 주었을 때의 SSPs는 TNT노출에서와 유사한 유도양상을 보여주었다. TNT에 노출된 Pseudomonas sp. HK-6세포에서 유도된 SSPs의 존재는 배양된 세포의 수용성 단백질 분획에 대하여 2-D PAGE를 통하여 확인되었다. Coomassie brilliant blue R25O로 염색된 젤로부터 pH 3-10 범위에서 약 450 개의 spots이 탐침되었으며, 이들 가운데 12 개의 spots이 TNT 스트레스에 대하여 현저하게 유도되었다. Gel상에서 가장 짙게 나타난 대표적 인 spot에 대한 N-말단 아미노산 서열을 분석한 결과, $^1XXAKDVKFGDSARKKML^17$로서, Pseudomonas putida의 GroEL의 N-말단 아미노산 염기서열인 $^1XXAKDVKFGDSARKKML^17$과 동일한 것으로 분석되었다.

효소면역전기영동이적법을 이용한 유조설고충 단세후군항체 및 환기혈청에 대한 항원특리성 분석 (Analysis of antigen specificity using monoclonal and polyclonal antibodies to cysticercus cellulosae by enzyme-linked immunoelectrotransfer blot technique)

  • 조승열;강신영;김석일
    • Parasites, Hosts and Diseases
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    • 제25권2호
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    • pp.159-167
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    • 1987
  • 기생충질환의 진단에도 이용하는 혈청학적 진단에서는 근록기생충항원과 교우반응이 나타나 특이도를 떨어뜨리는 경우가 있어 문제가 되고 있다. 진단용으로 사용하는 기생충노항원의 단백질 구성성분중 교*반응을 가장 잘 일으키는 것이 어떤 것인지를 알 수 있다면 특이도가 높은 항원을 제작하는 기본정보로 사용할 수 있을 것이다. 최근 SDS-폴리아크릴아마이드젤 전기영동(SDS-PAGE)과 효소면역전기영동이적법(EITB)을 이용하여 항원항체반응을 일으키는 단백질성분을 노항원중에서 구별할 수 있게 되었다. 이 연구에서는 유구낭미충의 낭액, 두절의 생리식염수추출액, 전낭미충추출액과 스파르가눔추출액, 포충낭액, 간질추출액, 간흡충추출액, 폐흡충추출액 등 8종의 항원에 대하여 유약낭미충증 환자 24명의 혈청과 본교실에서 제작한 단세포군항체가 어떻게 반응하는지 관찰하여 항원특이성을 분석하고자 하였다. SDS-폴리아크릴아마이드젤 전기영동은 길이 9cm, 두께 1.5mm인 10~15% linear gradient gel을 사용하였고 시료 $30{mu}l$를 sample buffier와 합께 $95^{\circ}C$에서 5분간 가열한 후 3~4시간 전기영동하였다. 분리된 단백질을 다시 100V에서 2시간 동안 Towbin buffer에서 전기영동하여 nitrocellulose 종이로 이적하였다. 그후 환자혈청(1 : 100), 단세포군항체(1 : 100)과 반응시키고 peroBidase-conjugated antihuman IgG(또는 perozidase-conjugated antimouse IgG), 기질의 순으로 반응시켜 발색하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. SDS-폴리아크릴아마이드젤 전기영동후 Coomassie brilliant blue R-250으로 염색한 바 유구낭미충 낭액에는 단백질대가 최소 23개 나타나고 그중 94, 64, 48, 39, 34, 24, 15, 10, 7kDa가 주단백질이었다. 두절추출액에는 단백질대 34개가 보였고 그중 94, 64, 39, 34, 26, 24, 21, 15, 10, 7kDa가 주단백질대이었다. 전낭미충추출액도 두절추출액과 동일한 소견을 보였다. 낭액항원과 충체추출액간에는 단백질 구성성분보다는 구성비의 차이가 심하였다. 스파르가눔 추출액은 28%, 포충낭액은 15%, 간질추출액은 22%, 간흡충추출액은 6개, 폐흡충추출액은 11개의 단백질대를 보였다. 2. 환자혈청 24개를 SDS-PAGE로 분리된 단백질대와 반응시킨 결과, 낭액항원에서는 평균 7.4개와 반응하였는 바 그중 152, 94, 72, 64, 48, 24, 15, 10, 7kDa 단백질이 가장 중요하였다. 두절 추출액과는 평균 6.3개와 반응하였고 그중 94, 64, 52, 39, 34, 15, 10kDa가 중요하였다. 스파르가눔추출액과는 평균 2.7개가 반응하였고 그중 130, 64kDa가 중요하였으며 포충낭액과는 평균 1개가 반응하였고 52, 27kDa가 중요하였다. 간질, 간흡충 및 폐흡충추출액과는 반응대가 관찰되지 않았다. 3. 단세포군항체는 낭미충낭액의 15, 10, 7kDa 및 두절추출액 10kDa와 반응하였다. 이상의 결과에서 유구낭미충의 구성단백질중 15, 10, 7kDa 등 저분자량단백질이 진단특이성이 높은 분획으로 판단하였다.

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