• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제4권1호
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• pp.67-77
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• 2000

심해에서 서식하며 특이한 조직형태를 갖고 있는 꼼치조직에서 cDNA를 제작하여 클로닝을 통해서, 꼼치에서 특이하게 발현하는 유전인자를 검색하였다. 그 결과 62례의 클론이 알려진 유전자에 동질성이 있었는데 이들은 thioesterase가 9례, myosin이 8례, creatine kinase가 7례, skeletal alpha-actin이 6례, parvalbumin b와 ribosomal protein이 각각 5례, type I collagen과 muscle troponin이 각각 3례, dopamine receptor, histatin, 그리고 heat shock protein이 각각 2례, cystatin, lectin, statherin, secretory carrier membrane protein, keratin type I, desmin, chloroplast, muscle tropomyosin, reticulum calcium ATPase, ribonucleoprotein이 각각 1례로 나타났다. 나머지 클론은 동질성이 낮거나 비반복성으로 나타났으며, 이 중 in situ hybridization으로 조직에서 특이하게 발현되는 5종류의 클론을 선택하여 분석하였으며, C 말단 단백질 구조와 특색(motif)을 분석하였다. 5종류의 클론에서 C9O-77은 약 5000bp 크기로 상피조직, 점액조직, 섬유조직 그리고 교원질 조직에서 강한 양성반응을 보이는 세포의 기질단백질로 예상되었다. C9O-116은 약 1500bp 크기로 섬유조직, 상피조직 그리고 점액조직에서 약한 양성반응을 보였고, 근육 다발 주변 부위 세포에서 매우 강한 양성반응을 보이는 막투과성 단백질로 예상되었다. C9O-130은 약 1200bp 크기로 상피조직, 근육조직 그리고 점액조직에서 양성반응을 나타냈으며, 특히 상피조직에서 강한 양성반응을 나타내는 세포내 단백질로 예상되었다. C9O-161은 약 2000bp 크기로 상피조직 과 근육조직 그리고 점액성 섬유조직에서 약한 양성반응을 보였고, 상피세포에서 강한 양성반응을 보였으며, 근육다발을 둘러싸는 섬유성 세포에서도 강한 양성반응을 보이는 세포외 기질단백질로 추측되었다. C9O-171은 약 1000bp크기로 상피조직, 근육조직 그리고 섬유기질 조직에 널리 강한 양성반응을 나타냈으며 교원띠조직에서도 양성반응을 보이는 전사인자로 추측되었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제41권2호
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• pp.81-88
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• 2014

식물생명공학 연구에 있어서 모델 식물인 Arabidopsis thaliana (애기장대)와 아주 유사한 염생 식물인 salt cress (Thellungiella halophila 또는 Thellungiella parvula)는 고염 스트레스에 대하여 강한 내성을 가지고 있다. 본 연구에서는 고염에 저항성을 가지는 유용유전자를 선별하기 위하여, 200 mM NaCl을 처리한 T. halophila 또는 T. parvula 식물로부터 mRNA를 분리하여 cDNA library를 작성하였다. Full length cDNA library를 Agrobacteria-methods 형질전환 방법에 필요한 binary vector pool을 작성하고 Arabidopsis에 형질전환 시켰다. 형질전환되어진 Arabidopsis를 항생제 Basta 선별을 통하여 형질전환체 pool을 구축하였다(305,400 종자). 이와 같은 방법을 통해 구축 되어진 pool중에서 168,500 종자를 이용하여 고염 스트레스 조건하에서 종자 발아율과 뿌리 생장 촉진되는 현상이 나타나는 내염성 형질전환체를 1차 선별하였다(7,157 개체; 4.24%). 1차 선별된 형질전환체 중에서 1,551개체를 이용하여 2차 선별을 수행하여 내염성 형질전환체 165 개체를 확보하였다(10.6%). 선별된 형질전환체 중 대부분 개체는 고염 스트레스에 대응하여 종자 발아 및 뿌리 생장 모두 야생형보다 촉진된 표현형을 보였다. 그 중 몇 몇의 형질전환체는 야생형에 비하여 특이적인 기관 발달 현상이 나타났다. 예를 들면, 꽃과 줄기의 발달이 야생형과는 다른 표현형을 보이는 형질전환체가 선별되었다. 이렇게 스트레스에 내성을 가지는 형질전환체로부터 유전자 분리 방법을 통하여 해당 유용유전자를 확보할 수가 있다. 본 연구에서는 향후 halopyte 식물체를 이용하여 고염 뿐만 아니라 다양한 환경스트레스(건조, 냉해, 고열, 호르몬 등) 신호전달에 관여하는 유용유전자를 보다 쉽게 확보하는 방법을 제시함으로서, 환경재해극복에 관여하는 신호전달 기작을 보다 쉽게 이해할 수 있을 것으로 사료된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제32권1호
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• pp.72-77
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• 2004

본 연구진은 토양미생물의 배양액으로부터 cyclin-dependent kinase 저해활성의 Toyocamycin을 분리하였으며 〔16〕, 화학적 전합성을 통하여 활성이 개선된 유도체인 신물질 MCS-5A를 합성하였다〔3〕. 이 MCS-5A를 이용한 항암 기전규명을 위한 연구를 통하여 , human promyelocytic leukemia cell(HL-60)에서 MCS-5A에 의해 cyclin-dependent kinase inhibitor p16$^{INK4A}$ 단백질의 발현증가가 암세포의 세포주기 억제와 동시에 HL-60 cell희 세포사멸을 유도하는 것을 확인하였다(data not shown). 그러나 HL-60 cell의 경우와는 달리 non small cell lung cancer cell(NSCLC)인 A549 cell(p16$^{INK4A}$ 결핍 세포주)에 MCS-5A를 처리할 경우에는 전혀 세포사멸이 유도되지 않았다. 따라서 MCS-5A에 의한 HL-60 cell에서의 세포사멸 유도는 발암억제 유전자인 P16$^{INK4A}$의 세포 내 발현 및 존재 여부에 의해 좌우되는 것으로 판단되었다. 이러한 배경에서 본 연구는 p16$^{INK4A}$.의 기존에 알려진 세포주기 억제를 유발하는 cyclin-dependent kinase inhibitor(CKI)로서의 역할 뿐 아니라, p16$^{INK4A}$ 유전자가 세포사멸을 유도할 수 있다는 새로운 기능을 규명하기 위하여 다음의 연구를 시도하였다. 즉 $p^{INK4A}$ 결핍 세포주인 A549(-p16/+p53)와 H1299(-pl6/-p53) 그리고 p16$^{INK4A}$ 함유 세포주인 HeLa(+p16/+p53)세포에 외부로부터 p16$^{INK4A}$ 유전자를 도입시켜, 각 세포주에서의 세포사멸 유도 여부를 비교하고자 하였다. 우선 wild-type p16$^{INK4A}$ 유전자를 가진 HeLa cell에서 총 RNA를 추출하여, 역전사 반응으로 cDNA를 만들고, PCR을 통해 p16$^{INK4A}$ 유전자를 증폭하였다. pcDNA3.1/His is A vector에 p16$^{INK4A}$ 유전자를 끼워 넣고 competent cell (XL1-Blue)에 형질 전환하여 cloning한 후, p16$^{INK4A}$ clone을 다량으로 추출하였다. 위에 언급한 각각의 cell line에 p16$^{INK4A}$유전자를 농도(0, 1, 5, 10$\mu\textrm{g}$)별로 transfection 시킨 후, p16 단백질을 일정 시간 동안(12시간) 발현시킨 뒤, TUNEL등의 분석을 통해 세포사멸이 유도되는지를 확인하였으며, 또한 Western blot 분석을 통하여 p16단백질과 세포사멸 유도 인자인 caspase 3의 발+현 양상을 확인하였다. 연구 결과, Western blot을 통해 transfection시킨 p16/INK4A/유전자의 농도에 따라 각각의 cell line에서 Pro-caspase 3의 감소함을 관찰할 수 있었고, TUNEL분석을 통해 A549및 HeLa cell에서 세포사멸이 유도됨을 확인할 수 있었다 특히 A549(-p16/+p53)와 HeLa cell(+p16/+p53)에서는 TUNEL 분석 및 Western blot을 통한 pro-caspase 3의 caspase 3로의 전환 등을 통해 세포사멸이 발생하였음을 확연하게 확인할 수 있었으나, 반면 H1299(-pl6/-p53) cell에서는 단지 Western blot을 통한 pro-caspase 3의 활성화만을 통해 간접적으로 세포사멸을 확인 할 수 있었다. 또한 p53이 결핍된 H1299(-pl6/-p53)세포주에서의 $^{INK4A}$ 에 의한 세포사멸 유도는 p53 비의존적으로 작용한다는 사실을 확인할 수 있었다. 결론적으로 발암억제 유전자인 $^{INK4A}$ 는 CKI로서의 기능뿐 아니라, 세포사별 유도와도 밀접하게 관련되어 있으며, 이 기능은 발암 억제 유전자인 p53과는 독립적으로 작용한다는 사실을 확인하였다. 세포사멸 유도 기전연구에서 $p16^{INK4A}$ 가 세포사멸을 유도하는 기전에 대해서는 아직 명확하게 밝혀진 바는 없으며, 현재 본 연구실에서 다양한 실험을 통해 연구가 진행 중이다.