• 한국미생물·생명공학회지
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• 제19권1호
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• pp.31-36
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• 1991

Tn5의 kanamycin 저항성 유전자를 가진 pBEL1 plasmid와 C.glutamicum cryptic plasmid인 pSR1으로 7.5kb의 새로운 plasmid를 만든 후, 이를 pCE1301이라 명명하였다. 이 pCE1301은 PEG1301은 PEG-protoplast법으로 C.glutamicum을 형질전환하였을 때 효율이 약 $3.0\times 10^3$형질전환제/$\mu g$이었으며 SalI과 EcoRI 제한효소 절단부위가 1개씩이었다. 또 Km이 없는 배지에서 25세대까지 안정하게 유지되었으며 B.flavum, E.coli에서 복제되었다. 이 pCE1301을 이용하여 C.glutamicum 의 homoserine dehydrogenase 유전자를 cloning하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제6권2호
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• pp.142-144
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• 1996

To clone the gene coding for steroid $\Delta^1$-dehydrogenase of Arthrobacter simplex, its genomic library was constructed with a , $\lambda$gt11 expression vector and immunoscreened with antiserum against the enzyme. One positive clone was found to carry a 1.6-kb EcoR I restriction endonuclease fragment of A. simplex DNA. The restriction map of the 1.6-kb EcoR I fragment was determined after cloning of the DNA into pBS vector.

• BMB Reports
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• 제32권5호
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• pp.497-501
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• 1999

Biotinylation of recombinant proteins is a powerful tool for the detection and analysis of proteins of interest in a large variety of assay systems. The recent development of in vivo biotinylation techniques in E. coli has opened new possibilities for the production of site-specifically biotinylated proteins without the need for further manipulation after the isolation of the recombinantly expressed proteins. In the present study, a novel vector set was generated which allows the convenient cloning and expression of proteins of interest fused with an N-terminal in vivo biotinylated thioredoxin (TRX) protein. These vectors were derived from the previously reported pBIOTRX vector into which was incorporated part of the pBluescript II+phagemid multiple cloning site (MCS), amplified by PCR using a pair of sophisticated oligonucleotide primers. The functionality of these novel vectors was examined in this system by recombinant expression of rat transforming growth factor-$\beta$. Western-blot analysis using TRX-specific antibodies or peroxidase-conjugated streptavidin confirmed the successful induction of the fusion protein and the in vivo conjugation of biotin molecules, respectively. The convenience of molecular subcloning provided by the MCS and the effective in vivo biotinylation of proteins of interest makes this novel vector set an interesting alternative for the production of biotinylated proteins.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제2권4호
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• pp.237-242
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• 1992

In order to clone the gene coding for alkaline phosphatase in the yeast Kluyveromyces fragilis, a genomic library was constructed using the yeast-E. coli shuttle vector pHN114 as a cloning vector. From the genomic library, a clone carrying the gene was isolated and the plasmid was designated as pSKH101. A restriction enzyme map was made using this plasmid. Subcloning experiments and complementation studies showed that alkaline phosphatase was active only in the original 3.1 kb insert. Southern hybridization analysis confirmed that the cloned DNA fragment was derived from K. fragilis genomic DNA. Using a minicell experiment, the product of the cloned gene was identified as a protein with a molecular weight of 63 KDa. A 0.6 kb HindIII fragment, which showed promoter activity, was isolated using the E. coli promoter-probe vector pKO-1.

• 미생물학회지
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• 제36권2호
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• pp.112-118
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• 2000

Bacillus circulans KCT3004 유래의 호산성 $\alpha$-amylase 유전자가 pUC19을 vector로 하여 대장균 내에서 클로닝 되었다. 클로닝된 5.8kb Pst I DNA절편은 pUC19내에서의 삽입방향과는 무관하게 $\alpha$-amylans보다 약40배 정도의 높은 효소활성을 나타내었다. 본 연구에서 클로닝 및 발현된 효소의 최적 pH와 온도는 각각 pH 3.6 $45^{\circ}C$였으며, $40^{\circ}C$에서 1시간 동안의 사전 열처리에도 활성의 감소를 일으키지 않았다. 이 효소는 SDS-PAG와 zymogram을 통해 분석해 본 결과 분자량은 약 55,000으로 추정되었으며 기질로 starch만을 가수분해하여 maltoriose 이상의 올리고당 분자들을 주로 생산할수 있었다.

• 미생물과산업
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• 제17권3호
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• pp.54-59
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• 1991

최근 유산균주의 개량에 대한 연구는 세가지 중요한 영역에 그 촛점을 맞추고 있다. 첫째 앞으로 산업적으로 중요한 유전자의 성격규명과 cloning, 둘째 유산균에 적합한 유전자 전달계(gene transfer system)의 개발, 셋째 cloning vector의 개발이다(Froseth와 McKay,1991). 이 논문에서는 발효제품에 관여하는 유산균들의 유전학적 연구 및 새로운 균주개량법에 대하여 최근 발표된 자료를 토대로 기술하려 한다.

• 한국미생물생명공학회:학술대회논문집
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• 한국미생물생명공학회 1986년도 추계학술대회
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• pp.517.1-517
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• 1986

고온 호알카리성 Bacillus K-17의 Protease gene의 구조해명과 성질을 알기 위해서, E. coli HB101에 pER 322를 Vector로 하여 Protease gene을 Cloning하여 형질전환 된 균주를 선정하였다. 선정균주의 pretense activity를 Bacillus K-17의 상대활성도와 매우 유사하였으며 균체외에 보다 많은 효소 활성도를 지니고 있었다. 제한효소 Hind III로 절단하면 약 1.8kb와 0.4kb의 2개의 fragments 가 생성되었으며 Southern hybridization 결과 Cloning 된 gene이 Bacillus K-17에서 유래된 것임이 확인되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제14권2호
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• pp.133-137
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• 1986

원생동물인 Tetrahymena thermophila의 17S-rDNA구조 및 hygromycin 내성 기구에 대한 연구의 일부로서 hygromycin 내성변이주 hmr3의 17S-rDNA를 대장균의 vector pBR 322에 cloning하였다. 우선 rDNA는 hot phenol-cresol 용액으로 추출하여 제한효소 Hind III 처리로서 약 2.2kbp의 17S-rDNA를 agarose 전기영동상에서 분리하였다. 이를 pBR 322에 cloning하여 wild type의 17S-rDNA probe와 colony hybridization시켜 선별하였다. 그중 5-19 균주의 recombinant plasmid로부터 17S-rDNA 의 전사 orientation위치가 pBR322의 tetracyline내성 유전자 쪽으로 삽입되어 있는 것을 확인하였다.

• 약학회지
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• 제31권2호
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• pp.116-125
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• 1987

It is still difficult and time consuming to obtain cDNA sequences that contain the entire nucleotide sequence of the corresponding mRNA. A rapid and high efficient cloning method to obtain full-length cDNA segments is thus developed. The cloning procedure described here consists of the construction of oligo(dT)-tailed vector primer using pWR34 plasmid, polyadenylation of mRNA-cDNA heteroduplex using terminal deoxytransferase, and replacement of MRNA strand with DNA by RNase H and DNA polymerase I. The restriction endonuclease analysis shows that the size of inserted-cDNA is in the range of 1.5~4.0 kb long suggesting that most of cloned cDNA are full-length or nearly full-length cDNA. The plasmid-DNA recombinants obtained were 4$\times$$10^5$~$10^{6}$ per $\mu\textrm{g}$ of rat liver poly (A$^+$)mRNA, which is 4 to 10 fold higher cloning efficiency in comparison to the presently used methods for full-length cDNA cloning. The results indicate that the described cloning system is much simpler, less time consuming, and very efficient cloning method to construct a cDNA library.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제14권2호
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• pp.161-168
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• 1986

E. coli-S. cerevisiae shuttle vector인 plasmid YRp7을 이용하여 B. amyloliquefaciens의 $\alpha$-amylase gene을 E. coli 내에 cloning하였다. 이때 제한 효소 Sau 3 AI에 의해 얻어진 $\alpha$-amylase gene의 크기는 약 1.95kb정도였으며 E. coli내에서 비교적 안정하게 유지되고 발현되었다. 재조합 plasmid p-EA24를 함유한 E. coli는 B. amyloliquefaciens의 약 65% 정도의 $\alpha$-amylase를 생성하였으며, 최적온도, pH, CaCl$_2$의 영향등 $\alpha$-amylase의 효소학적인 성질을 비교 조사해 본 결과 B. amyloliquefaciens의 $\alpha$-amylase와 동일하였다. 또한 E. coli에서 생성된 $\alpha$-amylase로 70% 정도가 periplasmic space에 존재하였으며 나머지는 세포 내부에 존재함을 알았다.