• 한국가축번식학회지
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• 제22권1호
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• pp.11-17
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• 1998

본 연구는 생쥐 완전탈출 배반포기배의 체내 발달율을 조사하기 위해 실시하였다. 공시된 완전탈출 배반포기배는 체내에서 생산된 전핵기 수정란을 5일과 6일동안 체외배양하여 얻었으며, 완전탈출 배반포기배의 직경을 기준으로 small(S-HBs), medium(M-HBs), large(L-HBs)로 구분하였다. 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 체외배양 4일째에 얻어진 배반포기배를 $24\sim48$시간동안 추가배양했던 바, 배양 5일과 6일째에 완전탈출 배반포기배의 발달율은 29.1%와 22.8%였다. 2) 또한, 완전탈출 배반포기배의 총 세포수를 조사하였던 바, S-HBs ($77.7\pm5.3$, $59.6\pm4.4$), M-HBs ($83.7\pm4.0$, $66.8\pm3.5$), L-HBs ($100.7\pm2.6$, $88.9\pm3.8$)로 나타나, 완전탈출 배반포기배의 크기가 증가함에 따라 총 세포수도 증가한다는 것을 알 수 있었다. 특히, S-HBs와 L-HBs의 총 세포수간에는 유의적인 차이가 있었다.(p<0.01). 3) 분류된 완전탈출 배반포기배를 가임신 3일된 대리모의 자궁에 이식하였을 때, 배양 5일째의 임신율과 착상율이 S-HBs (28.6%, 15.7%), M-HBs (44.4%, 30.9%), L-HBs (62.5%, 49.1%)로서 완전탈출 배반포기배의 크기가 커질수록 증가하였던 반면, 배양 6일째에는 이러한 양상을 볼 수 없었다. 그러나, 전체 착상율에 대한 정상산자율을 조사하였던 바, 배양 5일째의 S-HBs (87.5%)가 다른 군에 비하여 유의하게 높게 나타났다. (p<0.01). 따라서, 이러한 결과로 미루어 볼 때, 체외에서 배양된 건강한 완전탈출 배반포기배는 높은 임신율과 착상율 및 정상산자율을 얻을 수 있음을 확인하였던 바, 이는 인간포배기 배아이식시 잉여의 완전탈출 배반포기배의 유용성 검토를 위한 기초자료로서 이용될 수 있음을 시사한다고 하겠다.

• 한국발생생물학회:학술대회논문집
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• 한국발생생물학회 2003년도 제3회 국제심포지움 및 학술대회
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• pp.124-124
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• 2003

The successful development of embryos cloned by nuclear transfer (NT)have been dependent on a wide range of known factors including cell cycle of donor and recipient ooplast, oocyte quality, NT procedure and oocyte activation. The present study compared the development of cloned porcine embryos following different activation treatments. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were aspirated from 26 mm follicles of slaughterhouse ovaries and cultured for 22 h in NCSU #23 medium supplemented with 10% porcine follicular fluid, 0.57 mM cysteine, 0.5 g/mL LH, 0.5 g/mL FSH and 10 ng/mL EGF. The COCs were further cultured for an additional 22 h in the same medium at $39{\cird}C$ in an atmosphere of 5% $CO_2$ in air, without hormonal supplements. Primary cultures of fibroblasts isolated from a female fetus on day 40 of gestation were established in DMEM + 15% FCS. For nuclear donation, cells at the 5th-6th passage were cultured in DMEM +0.5% FCS for 5 days in order to arrest the cells in G0/Gl. After enucleation, oocytes were reconstructed by transfer of donor cells and fusion with three DC pulses (1.4 KV/cm, 30 sec) in 0.28 M mannitol containing 0.01 mM $CaCl_2$ and 0.01 mM $MgCl_2$. Eggs were then divided into three treatment groups, control (without further treatment, Group 1), eggs cultured in 10 g/ml cycloheximide (CHX) for 5 h (Group 2), and eggs cultured in 1.9 mM 6-dimethylaminopurine (6-DMAP) for 5 h (Group 3). The eggs were then cultured in sets of 30 in 60 I drops of NCSU#23 supplemented with 4mg/ml BSA (essentially fatty acid free) until day 7 at $39{\circ}C$ in a humidified atmosphere of 5% $CO_2$. On day 4 the culture were fed by adding 20 I NCSU #23 supplemented with 10% FBS. Development rates into blastocysts were significantly higher (P<0.05) in Group 3 embryos compared to Group 1 controls ($27.6 \mu 2.7% vs. 20.1 \mu 4.1%$, respectively), but rates did not differ in Group 2 compared to control ($23.8 \mu 5.7%$). Total cell number in Group 3 blastocysts was however significantly higher (P<0.05) than in Groups 1 and 2 ($44.6 \mu 2.4 vs. 19.9 \mu 1.9 and 21.9 \mu 2.1$, respectively). These results suggest that 6-DMAP is more efficient than cycloheximide in the activation of electrically fused NT oocytes during in vitro production of cloned porcine embryos.

• 한국수정란이식학회지
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• 제28권3호
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• pp.251-256
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• 2013

The present study was performed to investigate the effect of Hh-Ag1.5, a small-molecule chemical agonist of SMOothened receptor, on the in vitro maturation and development of in vitro fertilized (IVF) embryos in pigs. Oocytes or fertilized embryos were cultured in a maturation or embryo culture medium supplemented with 0 (control), 25, 50 or 100 nM of Hh-Ag1.5, respectively. Although the maturation rate were not different among treatment groups, the blastocyst formation rate in the group treated with 25 nM Hh-Ag1.5 was significantly increased compared to other groups (P<0.05). While the highest dose of Hh-Ag1.5 (100 nM) did negatively affect to the embryo development and cell number in blastocysts compared to other groups (P<0.05), the apoptotic cell index in blastocysts was significantly lower in 25 and 50 nM groups than in control and 100 nM groups (P<0.05). The mRNA expression of the proapoptotic gene Bax and the ratio of Bax/Bcl-XL decreased in among treatment groups compared to control (P<0.05). The embryo quality related genes, Tert and Zfp42, were significantly decreased in 50 and 100 nM groups compared with control and 25 nM groups (P<0.05). In conclusion, the addition of 25 nM Hh-Ag1.5 to in vitro maturation and culture medium can enhance the developmental potential as well as quality of IVF embryos in pig.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제30권3호
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• pp.207-212
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• 2006

본 연구는 물리적 탈핵 방법인 aspiration 방법과 squeezing 방법을 사용해 핵이식된 소 체세포 복제란의 발달능을 조사하였다. 두 방법에 의해 탈핵된 수핵란에 한우 귀피부 세포를 융합하여 체외에서 $7{\sim}8$일간 배양하여 발육능을 검사하였다. 배양 7일째 배반포 발달율은 aspiration 방법($31.9{\pm}13.4%$)과 squeezing 방법($33.6{\pm}15.7%$) 간에 차이가 없었다. 또한 배양 8일째 배반포 발달율도 squeezing 방법($35.3{\pm}15.1%$)과 aspiration 방법($37.8{\pm}10.4%$) 간에 차이가 없는 것으로 나타났다. 배양 7일째 배반포의 평균 세포수에 있어 각 처리 간에 차이가 없는 것으로 조사되었으며(aspiration: $110.3{\pm}39.2$, squeezing $103.7{\pm}42.8$), 세포자연사의 비율에 있어서도 역시 유의적인 차이가 없는 것으로 조사되었다(aspiration: $2.8{\pm}2.6%$, squeezing: $4.3{\pm}4.4%$). 본 연구의 결과는 물리적 탈핵 방법인 aspiration 방법과 squeezing 방법 모두 소 체세포 복제수정란의 생산을 위한 유용한 방법임을 보여준다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제39권3호
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• pp.89-95
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• 2015

체외 배양액에 성장호르몬 및 사이토카인의 첨가는 초기배 발육 및 생산된 배반포의 질에 영향을 미칠 수 있다. 본 연구는 돼지 유도만능줄기세포(porcine induced pluripotent stem cell, piPSC)의 조정배지(conditioned medium, CM)가 돼지 난자의 체외성숙 및 단위발생 후 초기배 발육에 미치는 영향을 검토하기 위하여 수행하였다. 난자-난구세포 복합체(cumulus-oocyte complex, COC)는 0(control), 25, or 50%의 줄기세포 배양액(stem cell medium, SM) 또는 CM이 첨가된 체외성숙 배양액으로 배양하였으며, 성숙된 난자는 활성화 유도 후 같은 농도의 SM 또는 CM을 첨가한 체외배양액에서 배양하였다. 체외 성숙율은 CM-25% 그룹에서 대조구보다 유의적으로 높았으나 (p<0.05), 다른 SM 또는 CM 처리구와는 차이가 없었다. 배반포 형성율은 CM-25% 그룹(29.2%)에서 대조구(20.7%), SM-50%(19.6%) 및 CM-50%(23.66%) 처리구보다 유의적으로 높았다(p<0.05). 배반포에서의 세포수 및 세포사 비율은 SM-25% 그룹이 대조구에 비하여 유의적인 차이가 나타났다(p<0.05). 난자의 질과 연관되어 있는 유전자들(Oct4, Klf4, Tert 및 Zfp42)의 발현은 CM-25% 그룹에서 대조구보다 유의적으로 증가되었다(p<0.05). 따라서 본 실험의 결과 체외성숙(IVM) 및 체외발달(IVC) 배양액에 25% 수준의 CM의 첨가는 돼지 단위발생 난자의 배발달과 난자의 질적 향상에 기여하는 것으로 사료된다.

• Reproductive and Developmental Biology
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• 제34권3호
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• pp.127-134
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• 2010

This study was to investigate the effect of flavonoid treatment on in vitro development of bovine somatic cell nuclear transfer (SCNT) embryos, and their pregnancy and delivery rate after embryo transfer into recipient. In experiment 1, to optimize the flavonoid concentration, parthenogenetic day 2 ($\geq$ 2-cell) embryos were cultured in 0 (control), 1, 10 and $20\;{\mu}M$ flavonoid for 6 days. In the results, in vitro development rate was the highest in $10\;{\mu}M$ flavonoid group (57.1%) among treatment groups (control, 49.5%; $1\;{\mu}M$, 54.2%; $20\;{\mu}M$, 37.5%), and numbers of total and ICM cells were significantly (p<0.05) higher in $10\;{\mu}M$ flavonoid group than other groups. We found that $10\;{\mu}M$ flavonoid treatment can significantly (p<0.05) decrease the apoptotic index and derive high expression of anti-oxidant, anti-apoptotic, cell growth and development marker genes such as Mn-SOD, Survivin, Bax inhibitor, Glut-5, In-tau, compared to control group. In experiment 2, to produce the cloned Jeju Black Cattle, beef quality index grade 1 bull somatic cells were transferred into enucleated bovine MII oocytes and reconstructed embryos were cultured in $10\;{\mu}M$ flavonoid added medium. When the in vitro produced day 7 or 8 SCNT blastocysts were transferred into a number of recipients, $10\;{\mu}M$ flavonoid treatment group presented higher pregnancy rate (10.2%, 6/59) than control group (5.9%, 2/34). Total three cloned Jeju Black calves were born. Also, two cloned calves in $10\;{\mu}M$ flavonoid group were born and both were all healthy at present, while the one cloned calf born in control group was dead one month after birth. In addition, when the result of short tandem repeat marker analysis of each cloned calf was investigated, microsatellite loci of 11 numbers matched genotype between donor cell and cloned calf tissue. These results demonstrated that the flavonoid addition in culture medium may have beneficial effects on in vitro and in vivo developmental capacity of SCNT embryos and pregnancy rate.

• 한국가축번식학회지
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• 제23권1호
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• pp.85-92
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• 1999

본 연구는 동결동결보호제의 종류와 배발달단계가 생쥐의 OPP vitrification 동결방법에 미치는 영향을 알아보고자 실시하였다. 동결속도, 동결보호제 및 배발달단계는 vitrification 방법에 따른 수정란의 생존성에 영향을 미칠 수 있다. 본 연구에 사용된 동결보존액은 40% (v/v) ethylene glycol, 18% (w/v) Ficoll, 0.3 M sucrose와 5% FCS가 첨가된 D-PBS (EFS) 및 16.5% ethylene glycol, 16.5% dimethyl sulfoxide, 0.5 M sucrose 와 5% D-PBS (EDS)을 이용하였다. 배반포기배는 hCG 처리후 90시간째에 자궁으로부터 채취하여 실험 1에 이용하였고, 실험 2와 3에서는 zygote 를 hCG 처리후 18시간에 난관에서 채취하여 mHTF 배양액에 5% $CO_2$, 37$^{\circ}C$ 조건하에 배양하면서 2-, 4-, 8-cell, compacted morula, 또는 blastocyst를 이용하였다. 실험 1에서 배반포기배의 적당한 동결보존액을 결정하기 위하여 EFS 또는 EDS로 OPP vitrification 을 실시하였다. 재확장배반포기에 의한 생존율은 대조군과 EDS 처리군 (100, 100%) 이 EFS 군 (95.0%) 보다 유의적 (P＜0.05)으로 높게 나타났으나, 부화배반포기에서는 EFS 군 (90.0%) 이 대조군 (100%) 및 EDS 군 (95.0%) 보다 유의적으로 낮은 발달율을 보였다. 실험 2에서는 zygote, 2-, 4-, 8-cell, 상실배 빛 배반포기 등의 초기배에서도 OPP vitrification 동결방법이 적당한지를 판단하기 위하여 실시하였다. Zygote (70.0%) 는 동결융해 후 배발달율이 2, 4, 8, 상실배 및 배반포기배에 비하여 유의적으로 낮은 발달율을 보였다 (89.7, 90.0, 92.8, 97.6 및 97.5%) (P＜0.05). 또한 동결융해란의 할구수에서는 대조군 및 배반포기배 (35.7$\pm$2.98 및 39.6$\pm$2.81)에서 zygote, 2-, 4- 8-cell, 상실배 (29.8$\pm$3.21, 31.3$\pm$3.83, 29.3$\pm$3.58, 28.9$\pm$3.21 및 30.8$\pm$2.93) 보다 유의적으로 높게 나타났다 (P＜0.05) 실험 3에서는 zygote의 VS1 에 노출시간에 따른 생존율을 조사한 결과 융해후 2-cell (91.6, 88.5 및 88.9%) 및 배반포기 (83.3, 74.3 및 69.4%) 까지 배발달율은 1,2 및 3분간의 노출시간에 따른 유의적인 차이를 보이지 않았다. 또한 융해후 노출시간에 따른 할구수에서도 유의적인 차이를 보이지 않았다 (36.4$\pm$4.76, 32.4$\pm$4.67 및 27.6$\pm$4.52). 이상의 결과에서 OPP vitrification 방법은 EFS 또는 EDS 동결보존액에 따른 유의적인 차이 없이 이용될 수 있는 것으로 판단된다. 배발달단계에 따른 생존율은 zygote 의 초기배는 2, 4, 8, 상실배 및 배반포기보다 유의적으로 저조한 생존율을 보였다. Zygote의 VS1에 노출시간에 따른 생존율도 1 분간의 노풀시간에서 높은 배발달율을 보였다. OPP vitrification 동결보존방법으로 생쥐수정란의 동결보존에 유용하게 이용가능한 것으로 판단된다.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제23권4호
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• pp.456-464
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• 2010

RNA interference (RNAi) is an acknowledged useful and effective tool to study gene function in various cells. Here, we suppressed the Connexin 43 (Cx 43) gene expression during in vitro development of ovine pre-implantation embryos using the RNAi method. The 353 bp Cx 43 double-stranded RNA was microinjected into in vitro fertilized ovine zygotes, and the levels of target mRNA and protein were investigated. Control groups included uninjected zygotes or those injected with RNase-free water. The dsRNA injection resulted in the specific reduction of Cx 43 transcripts as analyzed by quantitative real-time RT-PCR and decreased protein levels as shown by Western blot analysis at the blastocyst stage. Microinjection of Cx 43 dsRNA led to 20.3%, 21.7% and 34.5% blastocyst rates and 19.2%, 37.5% and 41.3% hatched blastocyst rates in Cx 43 dsRNA-injected, water-injected and uninjected groups, respectively. Then the RNAi could not significantly affect cell number and cell death rates of blastocysts. Therefore, suppression of Cx 43 dsRNA and proteins did not apparently affect the development potential of ovine pre-implantation embryos but may play a role in embryo quality. RNAi technology is a promising approach to study gene function in early ovine embryogenesis.

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제29권8호
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• pp.1095-1101
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• 2016

Ginsenoside Rg1 is a natural compound with various efficacies and functions. It has beneficial effects on aging, diabetes, and immunity, as well as antioxidant and proliferative functions. However, its effect on porcine embryo development remains unknown. We investigated the effect of ginsenoside Rg1 on the in vitro development of preimplantation porcine embryos after parthenogenetic activation in high-oxygen conditions. Ginsenoside treatment did not affect cleavage or blastocyst formation rates, but did increase the total cell number and reduced the rate of apoptosis. In addition, it had no effect on the expression of four apoptosis-related genes (Bcl-2 homologous antagonist/killer, B-cell lymphoma-extra large, Caspase 3, and tumor protein p53) or two metabolism-related genes (mechanistic target of rapamycin, carnitine palmitoyltransferase 1B), but increased the expression of Glucose transporter 1 (GLUT1), indicating that it may increase glucose uptake. In summary, treatment with the appropriate concentration of ginsenoside Rg1 ($20{\mu}g/mL$) can increase glucose uptake, thereby improving the quality of embryos grown in high-oxygen conditions.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제4권1호
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• pp.29-35
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• 2000

A phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)는 인슐린 신호전달의 상위구성 요소로 다양한 세포에서 단백질합성을 촉진한다. PI3K와 하위의 mammalian target of rapamycin (mTOR)가 착상전 생쥐 배아의 인슐린 신호전달에 관여하고 있는지의 여부를 조사하고자 하였다. 생쥐의 8-세포기 배아를 인슐린 또는 PI3K및 mTOR의 억제제를 포함한 조건에서 배양하면서 발생율, 할구수, 단백질합성 및 인산화를 조사하였다. 인슐린의 첨가는 포배형성과 부화 등 형태발생을 촉진하며 포배내 평균 할구수, 8-세포기 배아의 단백질 합성과 인산화를 유의하게 증가시켰다. PI3K의 억제제인 wortmannin과 mTOR를 억제하는 rapamycin은 인슐린에 의한 발생율, 포배내, 할구수, 단백질합성의 증가 효과를 상쇄하였다. 오토라디오그라피에서 두종의 인산화단백질인 pp22와 pp30의 인산화가 인슐린 처리에 의해 증가함을 확인하였다. 이상의 결과에서 생쥐 8-세포기 배아의 발생을 촉진하는 인슬린 신호의 전달에 PI3K와 mTOR가 관여함을 알 수 있다.