• KSBB Journal
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• 제15권2호
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• pp.125-133
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• 2000

Astaxanthin의 산업적인 생합성을 위하여 wild type인 P.rhodozyma B30 효모를 UV, NTG 등으로 돌연변이 처리하여 0.5 mM $\beta$-ionone이 포함된 선별배지에서 carotenoids 합성능력이 우수한 변이주 B76을 분리하였다. 변이주 B76은 wild type과 비교시 균체 생성능력은 큰 차이가 없었으나 carot-enoids 합성능력은 40% 이상, astaxanthin 합성능력은 50% 이상 향상되었다. 선별된 변이주 B76의 최적 발효배지 및 배양 조건 선정을 위한 플라스크 배양실험 결과 최적 탄소원으로 glucoserk, 최적 질소원은 CSL : (NH4)2SO4 : yeast extract = 6 : 2 : 0.1이 혼합된 배지가 선정되었다. C/N ratio는 1.7~2.0 범위에서 유사한 발효성능을 보았으며(산업적인 생산성을 고려하여 2.0을 최적으로 선정), 배양온도는 $22^{\circ}C$가 최적이었다. 초기 pH는 가장 높은 세포농도를 나타낸 6.0을 최적으로 하였다. 종균 접종량은 전반적으로 균체량과 carotenoids 합성능력에는 영향을 미치지 않았으며 산업적인 생산성을 고려하여 3%(v/v) 수준이 적절한 것으로 사료되었다. 이와 같이 플라스크 배양을 통해 확립된 최적 배지 및 배양조건을 기초로 5 L 발효조를 이용한 회분식 배양실험을 통해 탄소원의 최적 농도는 18%임을 확인하였다. 특히 B76 변이주는 22%(w/v)까지의 고농도 glucose 존재하에서는 catabolite rep-ression을 받지 않는 것으로 나타났다. 용존산소가 부족한 경우에는 균체성장 및 색소합성이 저해되었고, 따라서 통기속도 1.0 v/v/m, 교반속도 400 rpm 이상을 유지함이 필요하였다. B76 세포는 배양 3일차에 exponential phase에 진입한 후(최대 Yx/s = 0.37) 배양 4일차에 stationary phase에 도달하였다. Carotenoids 및 astaxanthin 생합성은 세포성장이 정지한 후인 배양 5일차에 급격하게 증가하는(최대 Yp/s = 1.08) 전형적인 mixed-growth-associated 형태를 나타냈다. 이는 exp-onential phase 동안 급격한 균체성장으로 용존산소가 부족하여 NADH balance에 의해 astaxanthin 생합성 경로 중 탈수소화 단계가 저해되기 때문으로 사료되었다. 최종 세포농도는 43.3 g/L, 단위부피당 carotenoids 함량은 149.4 mg/L, astaxanthin 함량은 110.6 mg/L로서 산업적인 생산성이 있는 것으로 나타났다. 이번 연구를 통하여 개발된 변이주 B76 및 이의 대량 발효를 위한 최종조건의 정립은 향후 astaxanthin의 산업적 생산공정에 필요한 기초자료로 이용될 것으로 기대된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제8권3호
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• pp.173-180
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• 1980

Streptomyces sp. strain K-17의 포도당 이성화효소의 강력한 분비를 위해서는 inducer로서 D-xylose를 필요로 하고 있다. 그런데 D-xylose를 가하지 않고 1.0% glucose를 가한 배지에서 배양한 이성화효소 역가가 낮은 균체를 모아서 이것을 다시 0.05M인 산 완충액 (PH7.0)에 현탁시켜 0.5 % xylose를 가하여 호기적으로 해주었을 때 효소의 induction pattern을 조사한 결과 효소활성이 10시간까지는 처리 시간에 따라 직선상으로 증가하고 이에 비례해서 D-xylose의 양이 감소했으나 cell mass에 있어서는 거의 변동이 없었다. 이때 효소단백의 합성이 일어나고 있지만, 전 RNA함량에 있어서는 오히려 감소하였다. 이와 같이 질소원을 가하지 않는 non-growth phase에서도 효소단백의 합성이 일어나는 것은 세포내에 축적되어 있는 단백질의 turn-over에 의한다는 것을 starvation 실험에서 알 수 있었다. D-xylose 이외에 D-ribose, L-arabinose, D-glucose, D-mannose, citrate, succinate 및 tartrate는 inducer로서의 효과가 없었다. 효소의 induction시, D-glucose를 가했을 경우catabolite repression 이 일어났으며 succinate 나 citrate 에 의해서도 강하게 효소생성이 억제되었다. 이와 같은 현상은 growth phase에서도 마찬가지 결과를 나타내었다. Induction시, $Ba^{2+}$, $Mg^{2+}$ 및 $Co^{2+}$가 효소생성을 발전시켰으며, C $u^{2+}$, C$d^{2+}$, A $g^{+}$ 및 H $g^{2+}$ 와 같은 중금속이 효소생성을 저해하였고, mitomycin C 몇 penicillin G는 효소생성에 영향을 주지 못하였으나, actinomycin D, streptomycin, chlora-mphenicol 및 tetra cycline등에 의해 강하게 저해되었다. 또 p-CMB 및 uncoupler 인 arsenate와 2.4-DNP에 의해서도 효소생성이 저해되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권5호
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• pp.461-467
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• 1989

Hansenula polymoypha의 배양조건과 배지의 탄소원에 따른 alcohol-oxidase의 생성능을 비교하기 위하여 H. polymorpha CBS 4732, H. polymorpha CBM 11, 그리고 H. polymorpha Cooney의 3균주에 대하여 실험하였다. 배양조건에 따른 효소생성은 glucose를 탄소원으로 첨가한 mineral salt medium에서 균체를 정상기까지 배양하여 methanol이 함유된 배지에서 재배양하는 2단계 배양법의 경우가 균체를 직접 methanol 배지에 배양한 경우보다 효율적이었으며 생성된 총효소량은 전자의 경우가 후자에 비해 1.9배정도 많았다. 다음 탄소원에 따른 효소생성능을 비교하였다. 먼저 직쇄 alcohol을 탄소원으로 사용한 경우 mothanol을 제외한 ethanol, propanol, butanoL, 그리고 pentanol에서는 효소가 생성되지 않았고 또한 이 직쇄 alcohol을 methanol과 혼합한 경우에도 극미량의 생성에 그쳤다. 여러 가지 탄소화합물 (glucose, xylose, lactose, glycerol, galactose, saccharose, sorbose, tactic acid acetic acid)을 탄소원으로 사용하면 methanol에 의해 생성된 효소량의 1/10 정도 생성되었고 이들을 methanol과 혼합사용하면 효소생성량은 급격히 증가하였고, 특히 lactose와 tactic acid의 경 우는 methanol 단독사용시 보다 오히려 다량 생성되었다. 시험 3균주 중에서는 어떤 경우에서든지 H. polymorpha CBS 4732가 alcohol-oxldase 생성능이 가장 좋은 것으로 나타났다.

• 생명과학회지
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• 제7권1호
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• pp.30-38
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• 1997

내열성 {\alpha}$-amulase를 생산하는 미생물을 분리하기 위하여 각종 분리원으로 시료를 채취하여 55$^{\circ}C$ 이상에서 생육하고 가장 내열성 {\alpha}$-amulase 생산능이 우수한 균주를 분리, 동정한 결과 thermophilic Bacilus 속으로 추정되었다. 균체생육과 효소생산의 최적온도는 60~$65^{\circ}C$였고, 초발 pH8.0에서 가장 높은 효소생산능을 보였다. {\alpha}$-amulase 생산에 가장 양호한 탄소원은 soluble starch, dextrin, prtato starch, corn starch 등의 다당류이었으며 glucose, fructose 등의 단당류에서는 효소생산이 미약하거나 억제를 받았다. {\alpha}$-amulase 생산에 가장 중요한 질소원은 yeast extract이었따. 0.1% $CaCl_2{\cdot}2H_2O$, 0.001%의 Tween-80의 첨가는 {\alpha}$-amulase 생산성을 증가시켰다. 본 공사균이 생산한 조효소액의 특성을 검토해 본 결과, 8$0^{\circ}C$에서 최적 효소활성을 보였으며, 10$0^{\circ}C$에서도 23%의 잔존활성을 나타내었다. 최적 pH는 5.0이었다. $Ca^{2+}$은 효소활성 증진에는 영향을 미치지 않았다. 공시균으로부터 분리한 genomic DNA를 중온성 BAcillus subtilis KCTC 1024에 형질전환시킨 결과, transformant는 wild type에 비하여 약 2배의 효소활성이 증가되었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제39권6호
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• pp.443-448
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• 1996

xylA 유전자의 프로모터상에서 조절양상을 조사하기 위하여 xylA 유전자의 프로모터(Pxyl)와 lacZ 유전자를 연결한 Pxyl-lacZ 융합 유전자를 제작하여 xylose에 의한 ${\beta}-galactosidase$ 생산의 조절양식을 조사하였다. xylA 프로모터 부위를 분리하여 lac 프로모터가 없는 고복제수의 lac 오페론 백터인 pMC1403에 클로닝시켜 pMCX191을 제작하여 reading frame에 변화가 없는 Pxyl-lacZ 융합 유전자를 만들었으며 이 벡터에서 Pxyl-lacZ 단편을 분리한 후 저복제수 벡터인 pLG339에 클로닝시켜 pLGX191을 제작하였다. 상기 플라스미드들을 xylA 변이주인 DH77에 형질전환시켜 Pxyl-lacZ 융합 유전자에서 ${\beta}-galactosidase$의 발현조절을 조사한 결과 xylose 농도에 따른 유도, glucose에 의한 발현억제 및 cAMP에 의한 억제해제 양상 등이 염색체상의xylA 유전자의 발현조절과 같은 경향을 나타내었다. pMCX191과 pLGX191을 이용하여 유전자 투여 량 효과를 본 결과도 복제수에 따른 차이가 크지 않았다. xylA 프로모터 부위내 조절영역를 추정하기 위해 구조유전자 상류 -209 bp를 포함한 xylA 유전자를 pUC19에 클로닝시킨 pUX30에서 프로모터 부위가 부분결손된 벡터들을 제작하여 결손부위의 염기서열을 확인하였다. 이들 부분결손 xylA 프로모터를 가진 xylA 유전자에서 xylose isomerase의 발현을 조사한 결과, 번역 개시점에서 -166 bp 이상의 영역을 결손시킨 pUX31과 pUX32의 경우pUX30과 비슷한 발현 양상을 보인 반면 -120 bp 이상의 영역을 결손시킨 pUX33과 pUX34에서는 모벡터에 비해 약 30% 수준의 발현을 보였다. 또한 pUX33과 pUX34에서는 xylose 유도시 cAMP에 의한 발현 촉진효과도 볼 수 없었다. -59 bp 이상의 부위가 결손된 pUX35의 경우에는 전혀 xylA 유전자의 발현이 일어나지 않았다. 이러한 결과로 볼때 xylA 프로모터내의 조절부위는 -165 bp에서 -59 bp 사이에 존재하는 것으로 추정되었다.