• 생명과학회지
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• 제29권5호
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• pp.537-544
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• 2019

유전자 가위를 이용한 게놈편집 기술의 등장은 다양한 분야에서 분자육종에 대한 관심을 유발하였으며, 3세대 유전자가위 CRISPR 기술의 개발은 게놈편집을 통한 분자육종 시대를 가속화하고 있다. 본 연구에서는 최근 개발된 3세대 유전자 가위 CRISPR/Cas9을 이용하여 국내 보급품종인 백옥잠의 BmBLOS 유전자를 편집하여 돌연변이를 유도하고 유전형 및 표현형 검사를 통하여 유전자가위를 이용한 누에 분자육종가능성을 분석하고 이용기술을 확보하고자 하였다. 유전자 편집을 위하여 백옥잠의 BmBLOS 유전자의 염기서열을 구명하고, 이를 바탕으로 3종의 가이드 RNA를 합성하였다. 합성된 gRNA는 Cas9 단백질과 복합체를 형성시킨 후 BM-N 누에 세포주에 도입 후 T7 endonuclease I 분석을 통하여 편집효율이 가장 높은 B4N gRNA를 선발하였다. 누에 유전자를 편집하기 위하여 Cas9/B4N gRNA를 누에 초가 배아에 미세주사하고 사육하였다. 미세주사 후 부화율은 18% 가량으로 낮게 나타났으나 생존한 개체 중 돌연변이 발생율은 40% 이상으로 비교적 높게 나타났다. 또한 유전자 편집 G0 세대누에 중 70% 가량에서 표현형의 변화가 관찰되었고, 염기서열 분석결과 대부분의 개체에서 BmBLOS 유전자가 정상과 돌연변이가 같이 존재하는 이형접합자 형태로 나타났으며, 그 유전형 또한 모든 개체에서 다르게 나타났다. 이러한 결과에 비추어 볼 때 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 누에 분자육종의 가능성은 매우 높을 것으로 예상되나, 유전자 편집효율을 개선하고 동형접합자를 얻기 위한 교배 및 선발방법에 대한 지속적인 연구가 필요하다고 판단된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제27권4호
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• pp.205-211
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• 2023

INTS14/VWA9, a component of the integrator complex subunits, plays a pivotal role in regulating the fate of numerous nascent RNAs transcribed by RNA polymerase II, particularly in the biogenesis of small nuclear RNAs and enhancer RNAs. Despite its significance, a comprehensive mutation model for developmental research has been lacking. To address this gap, we aimed to investigate the expression patterns of INTS14 during zebrafish embryonic development. We generated ints14 mutant strains using the CRISPR/Cas9 system. We validated the gRNA activity by co-injecting Cas9 protein and a single guide RNA into fertilized zebrafish eggs, subsequently confirming the presence of a 6- or 9-bp deletion in the ints14 gene. In addition, we examined the two mutant alleles through PCR analysis, T7E1 assay, TA-cloning, and sequencing. For the first time, we used the CRISPR/Cas9 system to create a model in which some sequences of the ints14 gene were removed. This breakthrough opens new avenues for in-depth exploration of the role of ints14 in animal diseases. The mutant strains generated in this study can provide a valuable resource for further investigations into the specific consequences of ints14 gene deletion during zebrafish development. This research establishes a foundation for future studies exploring the molecular mechanisms underlying the functions of ints14, its interactions with other genes or proteins, and its broader implications for biological processes.

• Journal of Veterinary Science
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• 제21권2호
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• pp.26.1-26.14
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• 2020

Pancreatic ductal adenocarcinoma is a lethal cancer type that is associated with multiple gene mutations in somatic cells. Genetically engineered mouse is hardly applicable for developing a pancreatic cancer model, and the xenograft model poses a limitation in the reflection of early stage pancreatic cancer. Thus, in vivo somatic cell gene engineering with clustered regularly interspaced short palindromic repeats is drawing increasing attention for generating an animal model of pancreatic cancer. In this study, we selected Kras, Trp53, Ink4a, Smad4, and Brca2 as target genes, and applied Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9) and Streptococcus pyogens Cas9 (SpCas9) for developing pancreatic cancer using adeno associated virus (AAV) transduction. After confirming multifocal and diffuse transduction of AAV2, we generated SpCas9 overexpression mice, which exhibited high double-strand DNA breakage (DSB) in target genes and pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN) lesions with two AAV transductions; however, wild-type (WT) mice with three AAV transductions did not develop PanIN. Furthermore, small-sized Cjcas9 was applied to WT mice with two AAV system, which, in addition, developed high extensive DSB and PanIN lesions. Histological changes and expression of cancer markers such as Ki67, cytokeratin, Mucin5a, alpha smooth muscle actin in duct and islet cells were observed. In addition, the study revealed several findings such as 1) multiple DSB potential of AAV-CjCas9, 2) peri-ductal lymphocyte infiltration, 3) multi-focal cancer marker expression, and 4) requirement of > 12 months for initiation of PanIN in AAV mediated targeting. In this study, we present a useful tool for in vivo cancer modeling that would be applicable for other disease models as well.

• Molecules and Cells
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• 제46권1호
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• pp.4-9
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• 2023

The advent of the CRISPR-Cas genome editing platform has greatly enhanced the capabilities of researchers in many areas of biology. Its use has also been turned to the development of therapies for genetic diseases and to the enhancement of cell therapies. This review describes some recent advances in these areas.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제31권7호
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• pp.903-911
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• 2021

Previous studies have modified microbial genomes by introducing gene cassettes containing selectable markers and homologous DNA fragments. However, this requires several steps including homologous recombination and excision of unnecessary DNA regions, such as selectable markers from the modified genome. Further, genomic manipulation often leaves scars and traces that interfere with downstream iterative genome engineering. A decade ago, the CRISPR/Cas system (also known as the bacterial adaptive immune system) revolutionized genome editing technology. Among the various CRISPR nucleases of numerous bacteria and archaea, the Cas9 and Cas12a (Cpf1) systems have been largely adopted for genome editing in all living organisms due to their simplicity, as they consist of a single polypeptide nuclease with a target-recognizing RNA. However, accurate and fine-tuned genome editing remains challenging due to mismatch tolerance and protospacer adjacent motif (PAM)-dependent target recognition. Therefore, this review describes how to overcome the aforementioned hurdles, which especially affect genome editing in higher organisms. Additionally, the biological significance of CRISPR-mediated microbial genome editing is discussed, and future research and development directions are also proposed.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제49권4호
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• pp.534-542
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• 2021

CRISPR/Cas를 이용한 유전체 편집과 유전자 발현 조절을 위한 기술에서 sgRNA는 표적서열을 인식하는 역할을 한다. gal 프로모터를 표적서열로 하여 유전체 편집에 필요한 sgRNA의 표적인식서열의 길이와 유전자 발현 조절에 필요한 sgRNA의 표적인식서열의 길이를 Cas9-NG에서 체계적으로 비교하였다. 유전체 편집의 경우, sgRNA의 표적인식서열을 구성하는 20개의 뉴클레오티드에서 3개의 뉴클레오티드의 결손만을 허용하였다. 하지만, 유전자 발현 조절에는 표적인식서열에서 11개의 뉴클레오티드가 결손되어도 표적서열을 인식하고 결합할 수 있다는 것을 밝혔다. 따라서, sgRNA의 표적인식서열에서 4개 이상의 뉴클레오티드의 결손이 있는 경우에 sgRNA/Cas9-NG는 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합을 하지만, 엔도뉴클레아제의 활성을 갖지 못하기 때문에 유전체 편집을 할 수 없는 것으로 판단된다. 이 결과는 인공전사인자 개발과 합성생물학 분야의 다양한 CRISPR 기술 발전에 도움을 줄 것이다.

• 의료법학
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• 제23권1호
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• pp.121-148
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• 2022

유전자가위 CRISPR-Cas9은 유전자편집을 위한 생명과학기술 가운데 하나로서 무한한 잠재력을 지니고 있다. 이는 인류에게 많은 혜택을 줄 수도 있으며, 또는 예측하기 어려운 도전과제를 남겨줄 수도 있다. 유전자편집의 표준 또는 규제를 위한 거버넌스는 이러한 기술로부터 발생할 수 있는 연구자의 과학 발전을 위한 목적과 윤리적 책무 사이의 충돌을 합리적으로 해결해기 위한 절차적 방식이다. 관련 연구자들을 비롯한 그의 연구로부터 영향을 받을 수 있는 당사자들이 거버넌스 절차를 통해서 연구자들의 유전자가위 CRISPR-Cas9을 남용한 연구를 경계하기 위한 그들의 책임의식 향상에 기여하여야 한다. 이러한 거버넌스 절차는 연구자들의 책임의식을 어떻게 효과적이고 실효적으로 고양시켜줄 것인지 확인시켜줄 수 있다. 즉 세계적으로 논의되고 있는 유전자가위를 활용한 인간 배아에 대한 연구가 누구를 위해서 진행되는지 명확히 하여야 한다. 연구를 통한 과학적 호기심의 해결이 유전자가위를 활용한 인간 배아 연구의 목적이 될 수도 있다. 하지만 이러한 연구의 목적인 인간 배아는 단순한 연구의 도구로 취급되어서는 안된다. 그러므로 거버넌스는 유전자치료에 관한 연구를 장려하는 것과 더불어 연구자들의 책임의식을 고양하여야 한다. 그렇지 않으면, 과학 발전만을 위한 연구만 남을 것이고, 이러한 연구는 인류에게 기술을 통한 혜택보다 오히려 불행을 초래할 수 있다. 그러므로 이 글은 연구자의 책임의식을 고양하기 위한 거버넌스를 중심으로 연구하는 것을 내용으로 한다.

• 한국동물생명공학회지
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• 제35권4호
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• pp.323-328
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• 2020

Direct injection of genome editing tools such as CRISPR/Cas9 system into developing embryos has been widely used to generate genetically engineered pigs. The approach allows us to produce pigs carrying targeted modifications at high efficiency without having to apply somatic cell nuclear transfer. However, the targeted modifications during embryogenesis often result in mosaicism, which causes issues in phenotyping founder animals and establishing a group of pigs carrying intended modifications. This study was aimed to establish a genomic PCR and sequencing system of a single blastomere in the four-cell embryos to detect potential mosaicism. We performed genomic PCR in four individual blastomeres from four-cell embryos. We successfully amplified target genomic region from single blastomeres of 4-cell stage embryo by PCR. Sanger sequencing of the PCR amplicons obtained from the blastomeres suggested that PCR-based genotyping of single blastomere was a feasible method to determine mutation type generated by genome editing technology such as CRISPR/Cas9 in early stage embryos. In conclusion, we successfully genotyped single blastomeres in a single 4-cell stage embryo to detect potential mosaicism in porcine embryos. Our approach offers a simple platform that can be used to screen the prevalence of mosaicism from designed CRISPR/Cas9 systems.

• Molecules and Cells
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• 제38권6호
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• pp.475-481
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• 2015

Programmable nucleases, which include zinc-finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and RNA-guided engineered nucleases (RGENs) repurposed from the type II clustered, regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system are now widely used for genome editing in higher eukaryotic cells and whole organisms, revolutionising almost every discipline in biological research, medicine, and biotechnology. All of these nucleases, however, induce off-target mutations at sites homologous in sequence with on-target sites, limiting their utility in many applications including gene or cell therapy. In this review, we compare methods for detecting nuclease off-target mutations. We also review methods for profiling genome-wide off-target effects and discuss how to reduce or avoid off-target mutations.

• International Journal of Industrial Entomology and Biomaterials
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• 제37권1호
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• pp.21-28
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• 2018

CRISPR/Cas9 gene editing system is an efficient method to mutation in a sequence specific manner. Here we report the direct transfection of the Cas9 nuclease and gene specific guide RNA can be used in BM-N cell line derived from Bombyx mori ovarian tissue to enfeeble function of endogenous gene in vitro. We have used gene editing system to negative regulation components of major signaling cascade, the Toll pathway, which controls B. mori resistance to microbe infections, such as fungi and gram positive bacteria. We demonstrate that the $I{\kappa}B-like$ protein Cactus may controls the activation of transcription factors such as Rel A and Rel B. The direct transfection of Cas9 nuclease and Cactus-specific guide-RNA complex may be used in BM-N cells to disrupt the function of endogenous genes in vitro. A mutation frequency of 30-40% was observed in the transfected cells, and various mutations caused the target region. Moreover, RT-PCR analysis revealed that Cactus gene was down regulated after these mutations. More importantly, mutation of BmCactus stimulated expression of lysozyme, moricin, and lebocin genes. These results suggest that the CRISPR/Cas9 systems are expected to efficiently induce site-specific mutations and it was possible to produce antimicrobial peptide through the gene editing.