• KSBB Journal
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• 제15권1호
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• pp.35-41
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• 2000

Xylitol을 당수용체로하여 당알콜 올리고당 gluosyl-xylitol을 생산하기 위하여 갭술고정화 전세포 CGTase를 제조하고자 하였다. CGTase를 생산하기 위하여 Bacillus macerans를 배양하는 경우 organic form의 질소원을 사용하는 경우 inorganic form의 질소원을 사용하는 경우보다 더 많은 CGTase를 생산하였고 배양도중 탄소원인 starch가 분해되는 동안 CGTase가 생성되었다. B. macerans에 의하여 생산된 CGTase는 80% 이상이 extracellular cnzyme 이며, intracellular enzyme은 20% 이내이었다. E. coh, C. glutamicum, S. cerevisiae 등과 달리 캡슐내부에 B. macerans를 접종하고 캡슐내부에서 고농도로 배양할 수 없었다. 배양액속에 존재하는 CGTase는 다른 이온성 물질들로 인하여 활성탄, Ambolite, Sephadex 등의 흡착제에 흡착시킬 수 없었다. 미생물을 배양한 배양책 전체를 10배로 농축하여 캡슐내에 고정화함으로써 캡슐고정화 전세포 CGTase를 제조할 수 있었다. 농축배양액을 이요하여 제조된 캡슐고정화 전세포 CGTase는 hydrolysis, intermolecular transglycosylation을 수행하였으며, xylitol을 당수용체로 하고 dextrin을 당공여체ㅗ 하여 glucosyl-xylitol을 생산하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제19권4호
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• pp.368-371
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• 1991

Ethylene glycol, glycerol, sorbitol 그리고 sucrose가 Bacillus stearothermophilus가 생산하는 cyclodextrin glucanotransferase(CGYase)의 열안정성에 미치는 영향을 조사하였다. Glycerol, sorbitol 그리고 sucrose가 CGTase의 열안정성에 효과가 있었다. 이 효과는 첨가물의 농도와 밀접한 관계가 있었다. n-Butanol, 1,4-dioxane그리고 n-octane과 같은 유기 용매에서 CGTase의 열안정성을 조사하였다. 1,4-dioxane 과 n-octane은 CGTase의 열안정성을 증가시켰다. 특히, n-octane에서 CGTase를 $75^{\circ}C$에서 90분간 정치시킨 후에도 원래 효소활성의 81를 유지하였다.

• 생명과학회지
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• 제14권3호
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• pp.391-395
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• 2004

B. stearothermophilus NO2의 CGTase 유전자 (cgtS)를 구성적 $P_{JH}$ promoter 하류에 subcloning 하여 재조합 plasmid pIH-CGT1 (8.14 kb)을 구축하고 B. subtilis DB431에 형질 전환하였다. B. subtilis DB431/pJH-CGT1를 5가지 배지(LB, 2${\times}$LB, 5% molasses+2% CSL, CS, LBG)로 flask 배양하여 균체증식과 CGTase발현량 및 분비국재성을 조사하여 최적 배지를 결정하였다. 그 중 〔5% molasses+2% CSL〕 배지에서 9시간에 1.8 unit/$m\ell$의 CGTase가 발현$.$생산되었다. 이 결과를 토대로 3. subtilis DB431/pJH-CGT1를 〔10% molasses + 5% corn steep liquor〕 배지에서 발효조 회분 배양한 결과, 30시간 배양시 CGTase의 최대 발현량은 4.2 unit/$m\ell$, 90%의 분비 효율, 90% 이상의 plasmid 안정성을 나타내었다. 저렴한 산업용 molasses 배지로 발효조 회분배양시 플라스크 배양보다 균체증식과 CGTase 발현량이 2배 이상의 증가된 값을 얻었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제1권1호
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• pp.54-62
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• 1991

Cyclodextrin glucanotransferase(CGTase) derived from Bacillus macerans was immobilized by (1) covalent linkage on chitosan and chitin with glutaraldehyde, (2) adsorption on DEAE-cellulose and Amberite IRA 900 after succinylation, and (3) entrapment on alginate and polyacrylamide by cross linking. Adsorption on Amberite IRA 900 and covalent linking on chitosan were identified to be the most suitable immobilization methods considering the yield of activity and stability of immobilized CGTase. The enzymatic properties of immobilized CGTase were investigated and compared with those of the soluble CGTase. Thermal stability of CGTase immobilized on chitosan was increased from 50 to $55^{\circ}C$, and the optimum temperature of CGTase immobilized on Amberite IRA 900 was shifted from 55 to $50^{\circ}C$. The effect of molecular size of soluble starch (substrate) on immobilized CGTase investigated using partially liquefied substrates with different dextrose equivalent(DE). Cyclodextrin(CD) conversion yield augmented according to the increase of DE level for immobilized CGTase on Amberite IRA 900. CD conversion yield of partially cyclized starch with soluble CGTase was higher compared with liquefied one with ${\alpha}-amylase$.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제19권3호
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• pp.313-314
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• 1991

Bacillus stearothermophilus의 mutant가 생산하는 cyclodextrin glucanotransferase(CGTase)를 affinity chromatography법을 이용하여 정제하였다. 이 CGTase의 회수율은 95%이었고 specific activity는 26.2U/mg protein에서 485.5U/mg protein으로 증가하였다. 정제된 CGTase는 SDS-polyacrylamide gel 전기영동 결과 단일 band로 나타났다. CGTase는 affinity chromatography를 이용하여 one-step으로 정제할 수 있었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제1권1호
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• pp.63-69
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• 1991

Performance of column type bioreactor packed with immobilized cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) on chitosan and Amberite IRA 900 was evaluated for cyclodextrin(CD) production. For CGTase immobilized on chitosan, the maximum CD conversion yield of 42% was achieved at the range of 88-168 units of immobilizied CGTase per gram of chitosan, retention time of 0.3 hr, and from 5.0% (w/v) of partially cyclized soluble starch. On the other hand, for CGTase immobilized on Amberite IRA 900, the maximum conversion yield of 40% was obtained at the range of 3.6-11.0 units of immobilized CGTase per gram of carrier and retention time of 1.2 hr from 5.0% of substrate. Above CD conversion yields are almost identical level with that can be obtained with soluble CGTase of 47%. The productivities of bioreactor packed with immobilized CGTase were 17.0g of CD/lㆍhr for amberite IRA 900 and 15.5g of CD/lㆍhr for chitosan. The partially cyclized starch with soluble CGTase were more suitable as substrate to achieve better CD conversion yield, and 5% (w/v) of partially cyclized soluble starch containing 10% (w/w) of CD was found to be most suitable to obtain maximum CD conversion yield.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제30권4호
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• pp.293-297
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• 2002

효모 S. cerevisiae에서 B. stearothermophilus 유래의 CGTase를 발현 생산하였으며, 분비, 생산된 단백질을 정제하여 그 특성을 조사하였다. 재조합 효모 S. cerevisiae 2805/pVT- CGTS가 생산하는 CGTase의 분자량은 효모에서 발현될 때 고당쇄가 부가되어 야생형의 68kDa에 비해 15-160% 증가된 약 78-178 kDa으로 나타났다. 효모 S. cerevisiae에서 발현된 CGTase의 효소반응 최적활성조건은 pH7.0, $65^{\circ}C$였고, 열안정성에 있어서 $75^{\circ}C$에서 약 90%의 잔존활성을 가질 정도로 내열성이 개선되었다. 효모 S. cerevisiae에서 발현된 CGTase는 5% soluble starch를 기질로 약 40.2%의 CD 전환율 및 3 : 6 : 1의 $\alpha$-, $\beta$-, ${\gamma}$-CD의 생산 비율을 나타내어 야생형과 별다른 변화가 없었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제8권2호
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• pp.152-157
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• 1998

To analyze the role of the C and D domains in the cyclization activity of cyclodextrin glucanotransferase (CGTase), two plasmids, pKB1ΔC300 and pKB1ΔD96, were constructed in which DNA regions encoding 100 and 32 amino acids, respectively, from the C and D domains of B. stearothermophilus NO2 CGTase were deleted. The mutated CGTase from the pKBlΔC300 produced much lower amounts of ${\alpha}$-, ${\beta}$-, and $\gamma$-cyclodextrin (CD) than the parental CGTase. However, the mutated CGTase from the pKBlΔD96 showed a similar production pattern of CDs to wild-type CGTase. The production ratios of the ${\alpha}$-, ${\beta}$- and $\gamma$-CDs were not affected by the deletions, when compared to those of parental CGTase. The optimum temperature of the mutated CGTase from the pKBlΔC300 was decreased from $60^{\circ}C$ to $55^{\circ}C$. The optimum pH of the mutated CGTase from the pKB1D96 was shifted from 6.0 to 7.0. The thermostability of the two mutant CGTases were not changed. From these results, it is suggested that the C and D domains are not related to cyclization activity directly because mutant-enzymes deleted C or D domains still possessed their activity. However, they are important for other enzymatic properties such as productivity and pH optimum as a partition of CGTase tertiary structure.

• 생명과학회지
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• 제14권1호
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• pp.121-125
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• 2004

E. coli에서 B. macerans 유래 cyclodextrin glucanotransferase (CGTase)의 활성형 생산에 GroEL/ES chaperone과의 공발현과 저온 배양의 공동작용 효과에 대해 조사하였다. 실험에 사용된 cgt와 groEL/ES 유전자를 발현하는 pTCGTl과 pGroll은 각각 T7 promoter와 Pzt-1 promoter에 의해 조절되고 이들을 E. coli에 도입시켰다. 대수증식기 초기(2 hr)와 대수증식기 중기(3 hr)에 tetrarycline 10 ng/ml 과 IPTG 1 mM을 첨가하여 각각의 유전자를 발현시켰다. CGTase활성과 specific artivity 측정 시 $37^{\circ}C$에서 pTCGTl 단독 발현 보다 $25^{\circ}C$에서 chaperone과 함께 발현시킨 경우 2배나 높은 활성이 측정됐으며, SDS-PACE 분석결과 $37^{\circ}C$에서 단독 발현 시킬경우 20% 정도 가용성 형태로 발현되던 것이 $25^{\circ}C$에서 chaperone과 공발현 시에는 거의 3.5배가 넘는 69%가 가용성으로 전환됨을 알 수 있었다. 이와 같이 분자 chaperone과 $25^{\circ}C$에서의 저온 배양은 E. coli에서 활성형질 가용성 CGTase의 생산 증가에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2001년도 추계학술발표대회
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• pp.671-674
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• 2001

정제, 농축된 free CGTase 는 pH 6.0 - 7.0의 범위에서 안정하였으며, $70^{\circ}C$정도의 고온에서도 안정한 특성을 가지고 있었으며, CGTase의 고정화를 위한 방법으로서 CNBr-activated sepharose 4B에 의한 고정화가 가장 높은 효율올 나타내는 것으로 결정되었다. 고정화의 최적조건은 $30^{\circ}C$, 60rpm, pH 6.0의 phosphate buffer 하에서 9 시간 동안 고정화하는 것이었고, CNBr-activated sepharose 4B를 이용한 고정화의 경우 실험에 사용된 다른 모든 이온교환 수지에서 얻어진 효율에 비해 월등한 효과를 보였다.