• Journal of Animal Science and Technology
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• 제46권6호
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• pp.917-924
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• 2004

미토콘드리아 ND2 유전자와 세 가지 tRNA (tRNA-M앙, tRNA-Trp, tRNA-Ala)들이 포함}는 mtDNA 절펀의 PCR-RFLP haplotyping 기법으로 제주도에서 사육하는 한국 재래돼지를 포함하는 5개 품종에 대한 유전적 다양성을 조사하였다. 몇몇 돼지 품종에서 mtDNA 상의 제한절편 길이의 다형성이 관찰되었다. HaeIll-와 Hinf1RFLP에서는 두 가지 제한절편 유형, Tsp509IRFLP에서는 네 가지 유형으로 각각 구분되었다. 발견된 제한절편 유형들을 조협하여 mtDNA haplotype으로 구분했을 때, 모두 네 가지 haplotype들이 발견되었고 집단에 따라 각기 다른빈도를 나타내였다. 하나의 동일한 haplotype mtWB가 한반도 야생멧돼지와 Large White 집단에서 관찰되었다. Duroc과 Landrace 품종들은 여러 모계 선조에서 유래되었을 것으로 추정되는 두 가지의 haplotype들을 가지고 있었다. 제주도에서 사육되고 있는 한국재래돼지 집단에서는 muD와 mtJN haplonpe들이 관찰되었는데, 이 중 mtJN은 빈도가 높고 집단 특이적이었다. 본 연구의 결과는 제주 돼지 집단의 형성에 적어도 둘 이상의 모계 선조가 참여했으며, 이후 동아시아 언근 돼지 품종들과의 인위적인 교잡아 이루어졌을 것으로 추정된다. 연구진의 예상과는 달리 한반도 야생멧돼지가 제주 재래돼지 집단의 모계 선조라는 증거는 확인되지 않았다. MtDNA haplotype과 돼지 계통간의 관계 에서의 특이성은 돼지 육종에 있어 모계 확인과 계보 구성에 매우 유용한 정보를 제공할 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제23권1호
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• pp.85-92
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• 1999

본 연구는 동결동결보호제의 종류와 배발달단계가 생쥐의 OPP vitrification 동결방법에 미치는 영향을 알아보고자 실시하였다. 동결속도, 동결보호제 및 배발달단계는 vitrification 방법에 따른 수정란의 생존성에 영향을 미칠 수 있다. 본 연구에 사용된 동결보존액은 40% (v/v) ethylene glycol, 18% (w/v) Ficoll, 0.3 M sucrose와 5% FCS가 첨가된 D-PBS (EFS) 및 16.5% ethylene glycol, 16.5% dimethyl sulfoxide, 0.5 M sucrose 와 5% D-PBS (EDS)을 이용하였다. 배반포기배는 hCG 처리후 90시간째에 자궁으로부터 채취하여 실험 1에 이용하였고, 실험 2와 3에서는 zygote 를 hCG 처리후 18시간에 난관에서 채취하여 mHTF 배양액에 5% $CO_2$, 37$^{\circ}C$ 조건하에 배양하면서 2-, 4-, 8-cell, compacted morula, 또는 blastocyst를 이용하였다. 실험 1에서 배반포기배의 적당한 동결보존액을 결정하기 위하여 EFS 또는 EDS로 OPP vitrification 을 실시하였다. 재확장배반포기에 의한 생존율은 대조군과 EDS 처리군 (100, 100%) 이 EFS 군 (95.0%) 보다 유의적 (P＜0.05)으로 높게 나타났으나, 부화배반포기에서는 EFS 군 (90.0%) 이 대조군 (100%) 및 EDS 군 (95.0%) 보다 유의적으로 낮은 발달율을 보였다. 실험 2에서는 zygote, 2-, 4-, 8-cell, 상실배 빛 배반포기 등의 초기배에서도 OPP vitrification 동결방법이 적당한지를 판단하기 위하여 실시하였다. Zygote (70.0%) 는 동결융해 후 배발달율이 2, 4, 8, 상실배 및 배반포기배에 비하여 유의적으로 낮은 발달율을 보였다 (89.7, 90.0, 92.8, 97.6 및 97.5%) (P＜0.05). 또한 동결융해란의 할구수에서는 대조군 및 배반포기배 (35.7$\pm$2.98 및 39.6$\pm$2.81)에서 zygote, 2-, 4- 8-cell, 상실배 (29.8$\pm$3.21, 31.3$\pm$3.83, 29.3$\pm$3.58, 28.9$\pm$3.21 및 30.8$\pm$2.93) 보다 유의적으로 높게 나타났다 (P＜0.05) 실험 3에서는 zygote의 VS1 에 노출시간에 따른 생존율을 조사한 결과 융해후 2-cell (91.6, 88.5 및 88.9%) 및 배반포기 (83.3, 74.3 및 69.4%) 까지 배발달율은 1,2 및 3분간의 노출시간에 따른 유의적인 차이를 보이지 않았다. 또한 융해후 노출시간에 따른 할구수에서도 유의적인 차이를 보이지 않았다 (36.4$\pm$4.76, 32.4$\pm$4.67 및 27.6$\pm$4.52). 이상의 결과에서 OPP vitrification 방법은 EFS 또는 EDS 동결보존액에 따른 유의적인 차이 없이 이용될 수 있는 것으로 판단된다. 배발달단계에 따른 생존율은 zygote 의 초기배는 2, 4, 8, 상실배 및 배반포기보다 유의적으로 저조한 생존율을 보였다. Zygote의 VS1에 노출시간에 따른 생존율도 1 분간의 노풀시간에서 높은 배발달율을 보였다. OPP vitrification 동결보존방법으로 생쥐수정란의 동결보존에 유용하게 이용가능한 것으로 판단된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제17권1호
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• pp.45-53
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• 2002

본 연구는 sperm-mediated gene transfer를 이용하여 ICSI에 의한 형질전환동물 생산의 기초자료로서 활용하기 위해, ICSI에 사용될 정자의 조건과, 그에 따라 적합한 돼지 정자와 외래유전자의 전처리 및 ICSI를 통한 수정을 및 후기 배로의 발달율과 외래유전자의 발현 여부를 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다. ICSI에 이용될 정자의 조건에 따라 정소상체미부정자, 사출정자 및 동결정자를 이용하여 ICSI후 수정율은 각각 72.3%, 64.1% 및 74.1%로 나타나 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 또한 후기배로의 발달율에 있어서도 각각 17.6%, 18.7% 및 15.0%로 나타나 각 처리군간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 그리고, ICSI후 전기적 자극을 실시한 군과 실시하지 않은 군에서 난자의 활성화에 따른 수정율은 대조구로 이용한 shame injection과 전기적 활성화를 실시하지 않은 군에서 각각 47.1%와 46.3%로 나타나 전기적 활성화를 실시한 군의 79.6%에 비해 유의적인 차이를 나타내었다. 후기배로의 발달율에 있어서도 전기적 활성화를 실시한 군에서는 24.1%로 나타나 전기 적 활성화를 실시하지 않은 군에서의 14.4%와 유의적인 차이를 나타내었다. 그리고 대조구로 이용한 shame injection에 있어서 후기 배로의 발달율은 2.5%로 낮은 결과를 나타내었다. 또한, 정자와 pcDNA LacZ유전자의 처리시 electroporation 방법을 실시하여 ICSI후 난자를 각각 전기적 활성화를 실시한 군과 실시하지 않은 군에 있어서 유전자 발현율은 각각 30.2%와 24.2% 나타났으나, 두 처리군간에 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 그러나, 두 군에서 pcDNA LacZ 유전자는 모두 mosaic 발헌 양상을 보였다. 이상의 실험 결과들을 종합해 보면, ICSI에 사용될 수 있는 돼지의 정자는 정소상체미부정자, 사출정자 및 동결정자 모두가 이용 가능하며, ICSI후 추가 전기적 자극에 의한 난자의 활성화가 수정율과 후기 배로의 발달율을 향상시킬 수 있음을 시사하였다. 따라서, 돼지에 있어서 정자의 외래유전자 도입에 대한 정확하고 실용적인 방법은 보고되고 있지는 않은 상태로, 정자와 외래유전자의 처리법을 향상시키기 위하여 다양한 방법으로 많은 연구가 요구된다.

• 대한한방종양학회지
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• 제6권1호
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• pp.81-97
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• 2000

Objectives: This experimental study was carried out to evaluate the effects of aqueous and methanol extracts of Hedyotis diffusa which has long been used for cancer treatment in oriental medicines on the induction of apoptotic cell death in human lymphoid leukemia cell line, HL-60. Methods: Cells were treated with various concentrations (200 to $0.4{\mu}g$) and periods (6 to 30 hr) of $H_2O$ and methanol extracts of Hedyotis diffusa. Then, cells were tested for viability by MTT assay. Cells wrere treated with $200{\mu}g/ml$ of methanol extract fork various periods. Genomic DNA was isolated, separated, on 1.5% agarose gels, stained with ethidium bromide and visualized under UV light. Cells were treated with $200{\mu}g/ml$ of each extract for 16 hr. Then, cells were treated with Hoechst dye 33342 and observed by fluorescence microscopy. Cells were treated with various doses of each for 12 hr and $100{\mu}g/ml$ of methanol extract for various periods. Lysate from the cells used to measure the activity of Caspase-1 and-3 proteases by using fluorogenic peptide substrates including acetyl-YVAD-AMC and acetyl-DEVD-AMC, respectively. Cells were treated with $200{\mu}g/ml$ of each extract for various periods. Cell lysates were immunoprecipated with anti-JNKl antibodies. The immune complex was reacted with $32^p-ATP$ and c-Jun as a substrate. The phosphotransferase activity of JNKI was measured by using PhosphoImage analyzer (Fuji Co., Japan). Nuclear extracts were isolated and incubated with oligonucleotide probe of $NF-{\kappa}B$. Transcriptional activation of ${\kappa}B$ was measured by using EMSA and visualized by PhosphoImage analyzer (Fuji Co, Japan). Cell lysates were prepared and analyzed by Western blotting with anti-Bc12 antibodies and anti-Bax antibodies. Cells were pretreated with various doses of methanol extract for 2 hr. Then, the extract was removed by centrifugation. Cells were resuspended with RPMI-1640 media containing 0.3% agarose, 10% FBS, overlayred onto bottom layer agarose and incubated at $CO_2$ incubator for 6 days. The number of colony was counted under light microscopy ($\time100$). Results: The death of HL-60 cells was markedly induced by the addition of methanol extract of Hedyotis diffusa in a dose and time-dependent manners. The apoptotic characteristic ladder pattern of DNA strand break was observed in death of HL-60 cells. In addition, it was shown nucleus chromatin condensation and fragmentation under Hoechst staining. Therefore, Hedyotis diffusa extract-induced death of HL-60 cells is mediated by apoptotic signaling processes. The activity of Caspase 3-like proteases remained in a basal level in HL-60 cells treated with aqueous extract of Hedyotis diffusa. However, it was markedly increased in HL-60 cells treated with methanol extract of Hedyotis diffusa. In addition, the phosphotransferase activity of JNKl was increased in HL-60 cells treated with methanol extract of Hedyotis diffusa. Furthermore, the activation of transcriptional activator, $NF-{\kappa}B$ was markedly induced by methanol extract of Hedyotis diffusa. Anti-apoptotic Bc12 was cleaved into 23Kda fragment by treatment of methanol extract of Hedyotis diffusa. However, expression of proapoptotic Bax protein was increased by treatment of methanol extract of Hedyotis diffusa in a time-dependent manner. Furthermore, methanol extract markedly inhibited the colony forming efficiency of HL-60 cells in semisolid agar culture. Conclusions: Above results suggest that methanol extract of Hedyotis diffusa induces the apoptotic death of human leukemic HL-60 cells via activations of Caspase-3 proteases, JNKI, transcriptional activator $NF-{\kappa}B$, In addition, our results also suggest that methanol extract of Hedyotis diffusa reduces the malignant potential of HL-60 cells via down regulation of colony forming effciency through cleavage of Bc12 as well as induction of Bax.