• 한국수정란이식학회지
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• 제21권1호
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• pp.13-20
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• 2006

본 연구의 목적은 요를 통해 hFSH를 발현하는 형질 전환 소의 생산이다. 요의 분비와 관련 있는 유전자로서 mUII promoter를 사용하여 hFSH유전자를 구성했다. 태아섬유아세포(KbFF)는 임신 45일령의 태아(male)에서 채취하였다. hFSH gene은 pcDNA3(neo) vector와 같이 KbFF 세포에 electroporation 방법으로 transfection하였다. 유전자를 transfection한 세포는 G-418로 2주 동안 배양하였고, 선발된 colony는 PCR로 확인하였다. 핵이 제거된 난자는 hFSH가 transfection된 세포와 transfection 되지 않은(control) 세포를 이용하여 핵이식하였다. 48시 간 후 hFSH가 transfection된 세포는 68.7%의 수정란이 난할되었으며, 8일 후 15.7%의 수정란이 배반포로 발달하였다. 그러나 대조구에서는 67.6%가 난할되었으며, 24.5%가 배반포로 각각 발달하였다. 이들 배반포에서 apoptosis 분석 결과 hFSH 유전자가 transfection된 또는 transfection되지 않은 대조구에서 유의적인 차이는 보이지 않았다. 배반포는 53두의 수란우에 이식하여 두 마리의 산자가 생산되었으나(1.9%) hFSH가 transfection되지 않은 것으로 나타났다. 이 결과는 선발된 hFSH colony에서 transfection되지 않은 세포가 혼합되어 있었다는 것을 나타내 주고 있으며, colony의 선발과 검증에 더 많은 연구의 필요성이 있음을 나타내준다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제5권1호
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• pp.23-33
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• 2001

포유류의 난자가 수란관내로 배란될 때는 난포액 성분도 같이 수란관내로 들어간다. 본 연구에서는 처음으로 난포액의 일부 성분이 수란관액에 의해서 변화하는 것을 관찰하였다. 사람의 난포액을 gelatin zymogram으로 분석한 결과 621kDa gelatinase 이외에 110kDa gelatinase (GA110) 등의 여러 gelatinase 활성이 나타났다. 이 활성들은 EDTA나 phenanthroline에 의해 억제된 반면 PMSF 처리에 의해서는 아무런 변화가 없었다. 소의 수란관액에서는 62kDa gelatinase의 활성만이 주로 관찰되었다. 소의 수란관 액과 사람의 난포액을 1:1로 섞고 이를 37$^{\circ}$C에서 3시간 동안 둔 결과 사람의 난포액의 GA110 활성은 사라졌다. 사람의 난포액에 APMA를 첨가한 결과 GA110의 활성은 대부분 감소하고 대신 62kDa gelatinase의 활성은 오히려 증가하였다. 반면에 사람의 난포액에 EDTA를 3시간 동안 처리한 결과 GA110의 활성은 오히려 현저히 증가하였고 이 때 다른 gelatinases의 활성은 영향을 받지 않았다. PMSF나SBTI는 난포액내의 gelatinases활성에 아무런 변화를 일으키지 않았다. EDTA, PMTA 혹은 SBTI 등의 proteinase inhibitor를 미리 처리한 사람의 난포액에 소의 수란관 내액을 섞은 경우에도GA110의 활성은 여전히 감소하였다. 사람의 혈청에서도 EDTA에 의해 활성이 현저히 증가하는 GA110이 발견되었다. 사람의 난포액과 유사하게 혈청내의 GA110도 소의 수란관액에 의하여 활성이 사라졌다. 그러나 사람의 난포과립세포의 추출물에서는 단지 92kDa gelatinase만 관찰이 되었다. 마지막으로 anti-human gelatinase A 항체를 사용하여 사람의 난포액과 혈청 그리고 난포과립세포의 추출액을 western blotting한 결과 621kDa과 GA110 만이 항원-항체 반응을 나타내었다. 이 같은 결과로 미루어 사람의 난포액과 혈청에는 gelatinase A의 독특한 isoform인 GA110이 있으며 특히 난포액내의 GA110은 수란관액성분에 의해 선택적으로 분해되는 것으로 여겨진다.

• 한국가축번식학회지
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• 제24권1호
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• pp.49-57
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• 2000

본 연구는 소 태아섬유아세포를 이용하여 핵이식 후 세포의 휴면처리, 세포의 passage 수 및 세포의 기원이 복제란의 발육에 미치는 영향을 검토하였다.3.57개 월령 한우 수컷 태아의 피부 및 간 조직에서 세포를 채취하여 체외에서 4∼6 회 계대배양 후 동결하였다가 핵이식에 사용하였다. 세포는 핵이식 전에 혈청기아처리를 하였으며, 대조구로는 활발히 분열 중의 무처리 세포를 사용하였다. Donor 세포는 미수정란의 탈핵세포질에 이식 후 전기융합 및 활성화를 실시하였고, 재구축배는 7∼9 일간 체외배양하여 발육농을 검토하였다. 배반포로 발육된 일부 복제란은 발정 7∼8 일째의 수란우에 이식하였다. 복제란의 배반포 발육율은 혈청기아 처리구 (25.3%)가 무처리구 (15.9%)에 비하여 유의적으로 높았으나 (P＜0.05), 세포의 passage 수 (4∼6회) 에 관계없이 23.1∼25.0%로 나타났고, 피부 및 간유래 복제란의 배반포 발육율도 23.8∼25.2% 로 두 조직세포 간에 차이가 없었다. 복제란의 이식 후 60일 및 120일에 수란우의 34.4% 및 15.6%가 각각 임신이 확인되었으며, 초자화동결된 태아 피부세포 복제란으로부터 1두의 수컷 송아지가 생산되었다. 본 연구의 결과는 복제란의 체외발육능이 세포의 휴면처리에 의하여 향상되었으나, 세포의 passage 수 (4∼6 회) 및 세포의 두 기원 (피부 및 간) 에 의해서는 영향을 받지 않으며, 태아 피부세포 유래 복제란으로부터 산자가 생산될 수 있음을 확증한다.

• 한국가축번식학회지
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• 제21권2호
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• pp.167-176
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• 1997

본 연구는 수정란을 수란우에 이식하기 이전에 형질전환가능 수정란을 선발할 수 있다면 형질전환동물의 생산에 크게 도움이 되므로 3.2 kb $\beta$-actin promoter (lacZ/n대) DNA를 미세주입하여 배반포기배에서의 발현을 확인하여 이들을 선발할 수 있는가를 규명하고자 하엿다. 채란된 난포란은 10%FBS, 5$\mu\textrm{g}$/ml LH, 0.5$\mu\textrm{g}$/ml FSH, 100 unit/ml penicillin 및 100 $\mu\textrm{g}$/ml streptomycin이 함유된 TCM199에 22~24 시간동안 체외성숙을 유도후 5$\mu\textrm{g}$/ml heparin으로 수정능획득을 유도한 1$\times$106 sperm/ml의 정자로 체외수정을 시켰다. 체외수정후 18~20시간째에 vortexing에 의해 과립막세포를 제거하고 원심분리시켜 자/웅전핵이 확인되는 수정란의 핵에 3~4 ng/${\mu}\ell$ lacZ/neo DNA를 미세주입하였다. 모든 수정란의 배양은 3 mg/ml BSA, 20${\mu}\ell$/ml NEM AMINO acids 및 40${\mu}\ell$/ml BME amino acids가 함유되어 있는 CR1aa 배양액에 neo/DNA로 transfected 된 BRL 단층에서 실시하였다. G418에 대한 적정농도를 찾기 위하여 정상적인 수정란에 0, 50, 100 및 200 $\mu\textrm{g}$/ml G418를 첨가하여 배양한 결과 8일째에 30.3%(44/145), 8.7%(13/150), 0.7%(1/151) 및 0% (0/134)의 수정란이 배반포기까지 발달하였다. 그래서 본 실험에서는 일정하게 100$\mu\textrm{g}$/ml G418을 첨가하여 배양하였다. 총 1,127개의 수정란을 미세주입후 G418 없는 배양액에서 710개 (63.0%)가 분할하였다. 미세주입후 48시간째에 2-세포기이상 분할된 수정란을 대조구 및 100$\mu\textrm{g}$/ml G418처리구를 무작위로 할당하여 배양하였으며, 또한 740개의 정상수정란도 같은 반복수로 배양을 실시하였다. 미세주입한 수정란은 8일 후 11.6%(26/255) 및 5.2% (14/267)가 대조구 및 G418 처리구에서 배반포기까지 발달하였으며 정상수정란은 27.2% (151/740)가 배반포기 배까지 발달하였다. 미세주입후 대조구에서는 23.1$\pm$2.6/70.7$\pm$4.7 (32.7%)의 할구가 $\beta$-Gal 활력을 보였고, 반면에 100$\mu\textrm{g}$/ml G418 처리구에서는 40.3$\pm$4.1/48.8$\pm$7.5 (82.6%)가 $\beta$-Gal 활력을 보였다. 비록 mosaic 형태로 외래유전자가 발현되었지만 대조구에서 87.0% (26/30개) 배반포기가 $\beta$-Gal 활력을 보인 반면, G418 처리구에서는 모든 배반포기가 $\beta$-Gal 활력을 보였다 (P<0.05). 그러나 대조구 및 G418 처리구의 ICM colony에서는 영양배엽과 내배엽을 제외한 epiblast에서는 확인되지 않았다. 그러나 이 결과로부터 $\beta$-actin promoter/lacZ gene이 integration되지 않는 것인지 또는 다만 염색 확인이 되지 않는 것인지를 판단할 수는 없다. 이상의 결과는 미세주입후 G418에서 배양한 배반포기배에서는 대부분의 할구에서 주입된 gene을 발현하고 있었으나 ICM colony에서는 특히 epiblast에서는 발현되지 않거나 침묵하고 있었다. 비록 G418 처리구에서 훨씬 더 높은 비율로 주입된 gene이 발현되고 있으나 총세포수는 유의적으로 감소하여 이후 형질전환동물의 생산과 ES like-cell의 설립에는 감소될 것으로 사려된다. 그러나 형질전환 수정란의 선발 및 형질전환동물의 생산능력에 관해서는 더 많은 연구가 필요하다고 사려된다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제19권1호
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• pp.1-10
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• 2004

본 연구는 1997년 IMF 이후 급격히 감소된 한우의 두수를 증가시키고, 최근 젖소 송아지 가격이 현저히 낮게 형성되고 있어 양축가의 사기가 떨어지고 있는데 가임 젖소 암소에 한우 수정란을 이식시켜 한우 송아지를 생산케 함으로서 농가 소득을 증대시키고 실시하였다. 1. 체외수정 후 6, 7, 8 및 9일째의 수정란을 이식하여 59.4%, 68.2%, 66.0% 및 100%의 수태율을 나타냈으며, 상실배기(20.0%) 수정란이 배반포기(61.1%∼69.5%) 수정란보다 낮은 수태율을 나타내었다. 2. 수란우의 영양상태는 과비가 되지 않고 약간 야윈 듯한 체형을 선발하는 것이 좋은 것으로 나타났다. 3. 황체가 형성된 자궁각에 수정란을 이식한 결과 수태율이 70.1%로서 황체가 형성된 반대편 자궁각에 이식한 수태율 62.5%보다 높은 성적을 나타냈다. 4. 수란우에 수정란을 이식하기 전 hCG 1500 IU 와 GnRH 5 $m\ell$ 투여한 결과 69.9%를 나타내어 무처리구 63.0%보다 다소 높은 성적을 나타내었다. 5. 수란우와 공란우의 발정이 일치할 경우(0일) 이식 후 수태율이 72.6%로서 여타구보다 높은 성적을 나타내었다. 6. 수란우 산차에 따른 수정란 이식 후 수태율은 미경산우가 59.1%로서 경산우 70.6%보다 낮게 나타났다. 7. 수정란 상태에 따른 이식 후 신선란 및 동결란 수태율은 각각 70.6%와 36.4%를 나타내어 신선란이 높은 수태율을 나타내었다. 본 연구의 결과를 요약하면 체외 수정란은 체외배양 7일에 생산된 배반포 및 확장배반포기 수정란을 공란우와 수란우의 발정을 정확히 동기화 시키고, 수란우의 황체가 뚜렷하게 형성된 경산우를 이용하며, 이식 전 수란우에 Hormone을 처리하는 것이 수태율을 향상시키는 것으로 나타났다.