• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권4호
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• pp.295-300
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• 1989

B. thuringiensis가 생산하는 살충성 독소 단백질의 생태학적 응용방법을 개발하기 위한 목적으로 우선 독소 단백질 유전자를 옮겨 발현시키기에 적합한 숙주 미생물의 분리작업을 수행하였다. 국내 주요농산물인 고추, 감자, 무우 등 7가지 농작물의 뿌리부근에 군락을 형성하는 35종의 형광성Pseudomonas들을 분리하였고 독소 단백질 유전자를 함유하는 재조합 plasmid에 대한 숙주로서의 이응가능성을 검토해 보기 위하여 분리균주 35주에 대한 형질전환을 실시한 결과 4주에 독소 단백질 유전자의 도입이 가능하였고 생물검정과 면역학적인 방법 등에 의한 결과 BT 독소 유전자의 발현을 확인하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제10권2호
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• pp.221-226
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• 2000

Cephalosporin-C deacetylase (CAH) catalyzes the deacetylation of cephalosporin derivatives. A novel gene encoding the CAH from Bacillus sp. KCCM10143 was cloned and sepuenced. The uncleotide sequence contained an open reading frame encoding a polypeptide consisting of 217 amino acids and a molecular weight of 24 kDa which was in good agreement with the value obtained by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. An expression plasmid was constructed by inserting the CAH gene into the region of the pTrc99A expression vector. An active from of the CAH protein was expressed in the soluble fraction obtained after cell disruption. in fermentation using a 5-1 jar fementer, the transformant E. coli JM109 (pDST654) produced 4.12 U of CAH per ml of culture during 16 h of incubation.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제13권3호
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• pp.297-302
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• 1985

미생물중 urease생성능이 아주 강한 B. pasteurii의 Hind III partial digest 된 chromosomal DNA를 E. coli-B. subtilis bifunctional plasmid vector pGR 71으로 E. coli RR1 균주에 cloning 하므로써 그 urease gene을 expression시킬 수 있었다. 그러나 B. subtilis에서는 insertion DNA fragment의 deletion으로 expression되지 않았다. Cloning된 E.coli RR1 균주로부터 분리 정제한 urease gene함유 Plasmid(pGU66)의 restriction map을 작성하여 본 결과 7.1 Mdal의 insertion fragment가 삽입된 12.6Mdal의 plasmid에 Hind III, Bgl II, Xba I, Sal I등 몇 개의 cleavage site 위치를 찾을 수 있었다. Cloning된 E. coli의 urease는 periplasmic space에 많은 비율로 축적되며, 그 효소학적 성질은 donor인 B.pasteurii의 그것과 매우 유사하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제5권5호
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• pp.257-263
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• 1995

As a first step for developing Lactobacillus strains capable of fermenting starch directly, the $\alpha$-amylase gene (amyL) from Bacillus licheniformis (Kim et al., 1988. Kor. J. Appl. Microbiol. Bioeng. 16: 369-373) was introduced into Lactobacillus casei strains and the level of $\alpha$-amylase expression in transformants was examined. 3 kb EcoRI fragments encompassing amyL were subcloned into the suitable lactococcal cloning vectors (pSA3, pMG36e, and p1L2530) and then recombinant plasmids were introduced into E. coli and L. casei strains by electroporation. Only one recombinant plasmid, $pIL2530\alpha$ was able to transform few L. casei strains tested at low efficiencies. The transformation efficiencies with the plasmid into L. casei YIT 9018 and L. casei A Tee 4646 were less than $10^2/\mu$ g pIL2530\alpha$. The level of amylase activities in L. casei was five to ten-fold lower than that in E. coli cells. $p1L2530\alpha$ was stably maintained in Lactobacillus strains in the presence of Em (5 $\mu $g/ml) but without antibiotic selection, it was unstable so more than 95$%$ of cells lost plasmids after a week of daily subculturing.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제17권3호
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• pp.188-192
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• 1989

토양에서 분리된 알카리 내성 Bacillus sp. YA-14의 chromosomal DNA로부터 B. subtilis 207-25 에 cloning된 promoter 유전자들을 그 공여 균주로 재형질전환시킬 수 있었다. 그 결과 promoter 유전자들은 공여 균주내에서 대부분의 특성들이 B. subtilis 207-25 내에서와 유사하였다. 재조합 plasmid p-12, p-l2Bl 및 p-l2B2의 CAT 비활성은 B. subtilis 207-25의 형질전환체보다 약간 높게 나타났으며 반면 pPL708의 CAT 비활성은 Bacillus sp. YA-14에서 오히려 상대적으로. 낮게 나타났다. Chloramphenicol에 의한 induction 정도도 월등하게 높은 것으로 나타나 이를 이용한 expression vector의 유용성이 높은 것으로 생각되었다.

• 한국잠사곤충학회지
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• 제37권2호
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• pp.176-180
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• 1995

나비목과 파리목 곤충에 독성을 보이는 B. thuringiensis NT0423을 수용체로 하여 형질전환된 B. thuringiensis PT0529에서 원래 수용체가 생성하는 내독소 단백질과 도입된 CryIVD 및 CytA 단백질들간의 발현 특성을 분석하기 위하여, B. thuringiensis PT0529에서 내독소 단백질들간의 발현을 성장 과정에 따라 투과 전자 현미경 관찰 및 단백질 전기영동으로 분석하였다. 그 결과, B. thuringiensis PT0529에서 내독소 단백질의 발현은 원래의 수용체 내독소 단백질보다 도입된 CryIVD와 CytA가 먼저 합성되었으며, 그 발현량에 있어서도 높게 나타났다. 또한, B. thuringiensis PT0529에서 세가지 내독소 단백질은 그들 자신의 고유 형태로 잘 발현되었으나, 수용체인 B. thuringiensis NT0423의 내독소 단백질은 그 크기에 있어서 다소 작게 관찰되었다. 따라서 형질전환체 내에서 도입된 내독소 단백질 유전자의 발현은 수용체의 내독소 단백질 유전자 발현에 영향을 받지 않는 반면 외부 유전자의 도입으로 인하여 수용체가 생성하는 내독소 단백질은 그 발현에 있어서 간섭을 받는 것으로 나타났다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제16권3호
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• pp.368-373
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• 2006

Bacillus subtilis and related Bacillus species are frequently used as hosts for the mass production of recombinant proteins. Accordingly, this study examined the cellular response of B. subtilis to the overexpression of a soluble secretory protein. As such, the lichenase derived from B. cereus was overexpressed in B. subtilis, initially localized in the cytoplasm as a mature form and then secreted into the medium. Thereafter, the proteome of B. subtilis was analyzed using 2D electrophoresis and MALDI-TOF mass spectrometry. The expression of several heat-shock proteins, such as dnaK and groEL, was increased under this condition. In addition, manganese superoxide dismutase and NADH dehydrogenase were also upregulated in the lichenase-secreting B. subtilis. Therefore, it was concluded that the transient accumulation of a secreted protein in B. subtilis before secretion acted as a stress on the cell, which in turn induced the expression of various protective proteins.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제25권6호
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• pp.571-579
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• 1997

For the overproduction of pectate lyase (PL), the recombinant plasmid pl2BS fl which has strong promoter from alkali-tolerent Bacillus sp. YA-14 was used. In order to overexpress the pectate lyase by the action of overlapping strong promoter in pl2BS$\Delta$fl, 1.6 kb of PL gene was inserted into pl2BS$\Delta$fl to form pl2BS$\delta$f1-PL and the enzyme was expressed. But decreased expression efficiency of the PL gene was observed and it was due to the presence of the transcription terminator region on the upstream of the PL gene. The transcription terminator of the PL gene in pl2BS$\delta$f1-PL was removed and the resulting plasmid p12BS$\Delta$fl$\Delta$PL was formed. Bacillus subtilis 207-25 harboring the recombinant plasmid, p12BS$\Delta$fl$\Delta$PL, revealed increased expression efficiency with chloramphenicol induction when cat-86 was used as a reporter gene.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제19권4호
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• pp.348-355
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• 1991

Bacillus subtilis의 Beta-1,4-glucanase 유전자와 Saccharomyces cerevisiae의 alcohol dehydrogenase isoenzyme I 유전자 (ADHI)의 promoter와 mouse $\alpha$-amylase의 분비신호를 연결하여 분비형 플라스미드를 구성하였으며 이를 산업용 알콜생산 효모인 Saccharomyces cerevisiae 54에 도입하여 형질전환시켰다. 한편 $\beta$-glucanase 유전자의 발현정도를 증대시키기 위해 CYC1 유전자의 전사종결신호를 부가한 후 역시 Saccharomyces cerevisiae 54에 도입하였다. 형질전체들은 carboxymethyl cellulose가 함유된 평판배지에서 $\beta$-glucanase를 분비하고 있음을 확인할 수 있었다. 전사종결 신호가 부가된 경우엔 전체역가가 2배 정도 증가하였다. 형질전환체들이 세포밖으로 분비한 효소역가는 전체의 60 정도였다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제35권4호
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• pp.227-231
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• 1992

식물병원성 사상균에 대해 길항력을 갖는 그람음성 Pseudomonas fluorescens KR164의 chromosome에 그람 양성인 Bacillus thuringiensis(BT)의 HD-1 toxin gene을 삽입하기 위하여 이 유전자를 갖는 plasmids pSUPBT과 pSUPBTR을 작성하였다. Conjugation을 이용한 transposition으로 P. fluorescens KR164의 chromosome에 이 plasmids를 삽입시켜 BT toxin 유전자를 갖는 P. fluorescens KR164의 변이균주를 조제하였다. Southern blotting으로 균주의 cellular DNAs를 조사한 결과 모든 변이균주에서 한 개 이상의 BT toxin gene의 삽입이 확인 되었으며 독소단백질의 존재 역시 SDS-PAGE에 의해서 확인되었으며 이러한 독소단백질의 결정 생성은 전자현미경에서도 확인되었다.