• 한국가축번식학회지
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• 제23권1호
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• pp.75-84
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• 1999

본 연구는 토끼 전핵배의 효율적인 생산을 위한 동결방법과 조건 등을 찾고자 유리화 동결 및 완만동결법으로 동결ㆍ융해 후 체외배양하여 생존율 및 발달률을 조사하였다. 과배란시킨 토끼의 난관으로부터 채란된 전핵배를 동결에 공시하였다. 유리화 동결은 동결보호제로 EFS 와 EPG-I을 완만동결시는 EPG-II를 사용하였다. 동결ㆍ융해 후 5%, 39$^{\circ}C$ $CO_2$incubator 에서 소 난관상피세포와 공배양하였다. 본 실험의 결과는 다음과 같다. 동결보존을 위하여 동결보호제에 적절한 평형시간과 독성 여부를 판단하기 위하여 전핵배를 EFS 용액에 0~5분간 평형시킨 후 부화배반포로의 발달률은 1 분 군에서 72.0%로 동결보호제에 노출시키지 않은 대조구 (84.1%)에 비하여 무해한 결과를 얻었으나, 그 이상에서는 유해한 결과를 보여 주었다. EFS 노출 후 희석제로 sucrose와 D-PBS를, sucrose 사용 없이 D-PBS 만으로 희석하였을 때 유의적인 (P＜0.05) 차이를 보이지 않았다. 동결보호제에 있어서는 독성검사 및 동결ㆍ융해 후 발달률을 보아 EFS, EPG-. EPG-II는 동결보존에 있어서 동결보호제로서의 가능성을 보여주었으며 서로간의 유의적인 (P＜0.05) 차이는 찾아볼 수 없었다. 유리화동결에 의한 전핵배의 부화배반포로 발달률은 6.1%를 나타내었고, 완만동결에 의한 부화배반포 발달률은 11.5%로서 동결방법간에는 유의적인 (P＜0.05) 차이가 없었다. 완만동결시 동결속도가 전핵배의 투명대 파열에 미치는 영향을 규명하기 위하여 동결속도 및 침지온도를 달리하여 조사하였을 때 －35$^{\circ}C$ (25%) 보다는 －85$^{\circ}C$ 0.9%) 에서 액체질소에 침지하였을 때가 투명대 파열률에 있어 유의적인 (P＜0.05) 차이를 보였다. 이상의 결과로부터 전핵배는 현 배양상태에서 유리화동결 및 완만동결에 의하여 동결보존이 가능하다고 사료되나 전핵배의 배반포로의 발달률은 다소 저조하였다. 유리화동결 및 완만동결에 의한 전핵배는 후기 단계의 수정란보다 물리적, 화학적 손상에 더욱 민감하여 생존율 및 발달률에 영향을 미친다고 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제21권3호
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• pp.293-302
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• 1997

Follicular oocytes of Grade I and II were collected from 2~6 mm ovarian follicles and matured in vitro (IVM) for 24 hrs in TCM-199 su, pp.emented with 35$\mu\textrm{g}$/ml FSH, 10$\mu\textrm{g}$/ml LH, and 1$\mu\textrm{g}$/ml estradiol-17$\beta$ at 39$^{\circ}C$ under 5% CO2 in air. They were fretilized in vitro (IVF) by epididymal spermatozoa capacitated with heparin for 12 hrs. The zygotes were then co-cultured in vitro with bovine oviducted epithelial cells (BOEC) for 7 to 9 days. The optimal time for IVM, the successful enucleation of IVM oocytes by micromanipulation at different oocyte ages after IVM, and the ideal culture system for IVM for effective IVF and in vitro development of IVM-IVF embryos was examined for in vitro production of nuclear recipient oocytes and nuclear donor embryos. To improve the efficiency of nuclear transplantation (NT) of IVF embryo into IVM follicular oocytes, this study evaluated the optimal electric condition and oocytes age for activation of IVM oocytes and in vitro development of NT embryos. In vitro development of NT embryos with preactivation or non-preactivation in enucleation oocytes, cell number of IVN-IVF embryos, and NT embryos wre also examined. The results obtained were as follows; 1. The most suitable enucleation time was at 24 hpm (83.3%) rather than that of 28 hpm(69.6%) and 32 hpm(50.0%). 2. There was no difference among the fusion rates of NT embryos at the voltages of 0.75, 1.0 and 1.5 kV/cm, but the in vitro development rates to morule and blastocyst were significantly (P<0.05) higher at the voltage of 0.75(12.5%) and 1.0kV/cm (12.6%) compared to 1.5kV/cm(0%). 3. No significant difference in activation rates were seen in NT embryos stimulated for 30, 60 and 120 $\mu$sec (71.7, 85.2 and 71.9%, respectively), but the in vitro development rates to morulae and blastocyst were significantly (P<0.05) higher in the oocytes stimulated for 30 $\mu$sec (11.6%) and 60 $\mu$sec(10.7%) than 120 $\mu$sec(0.0%). 4. The fusion rates (71.0 and 87.3%) and the in vitro development rates (9.1 and 12.7%) to morula and blastocyst were seen in the NT embryos stimulated at 28 and 32 hpm under the condition of 1.0 kV/ml, 60 $\mu$sec. However, at 24 hpm the fusion rates were 64.8% and the in vitro development to morula and blastocyst were not seen. 5. The fusion rates between the 8~12, 13~17 and 18~22-cell stage of IVM-IVF embryos were not significantly different. The in vitro development rates of the fused embryos to morula and blastocyst which were received from a blastomere of 8~12, 13~17 and 18~22-cell stages of IVM-IVF embryos were 14.9, 8.3 and 6.5%, respectively. 6. The in vitro development rate of the enucleated recipient oocytes with preactivation (24.2%) to morula and blastocyst was significantly (P<0.05) higher than that of non-preactivation (12.8%). 7. The cell numbers of NT blastocyst and IVM-IVF blastocyst cultured during 7~9 days were 63$\pm$11 and 119$\pm$23, and then their the mean cell cycle number were 5.98 and 6.89, respectively.

• 한국가축번식학회지
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• 제24권1호
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• pp.97-108
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• 2000

본 실험을 통하여 얻어진 결과를 요약하여 보면, 1. 소난포(＜2 mm), 중난포 (2~6 mm) 및 대난포 (＞6 mm)에서 각각 184개, 157개 및 101개의 난포란을 회수하여 442개의 난포란을 채취하였으며, 난포의 크기별로 볼 때 Grade I인 난포란의 회수는 소난포에서 64개 (34.8%), 중난포에서 31개 (19.7%) 및 대난포에서 5개 (5.0%)를 회수하였으며, 등급별 총 회수율은 Grade I, II 및 III 에서 각각 100개, 170개 및 172개를 회수하였다. Grade I, II, 및 III의 난소당 채란된 수는 각각 2.4개 및 4.2개로 평균 난소당 10.7개의 난포란을 회수하였다. Grade I, II, 및 III 의 미성숙 난포란, 각각 200개, 196개 및 203개를 체외성숙 배양액에서 22~24 시간동안 배양한 결과, 188개(94.0%), 155개 (79.1%) 및 147개 (72.4%)의 난포란이 성숙되었으며, 수정율은 각각 88.3%, 76.6% 및 72.5% 였다. Grade I의 난포란의 성숙율 및 수정율이 Grade II와 III에 비하여 유의적 (P＜0.05)으로 높게 나타났다. TCM-199 배양액, 난관 상피세포가 첨가된 배양액 또는 난관 상피세포의 단순배양액 (CM) 에서 상실배의 발달율은 각각 24.1%, 31.2% 및 21.9%로서 CM 배양액보다 난관 상피세포에서 유의적 (P＜0.05)으로 높은 발달율을 얻었으며, 배반포 수정란의 경우, 발달율이 각각 12.4%, 24.7% 및 18.2%로서 TCM-199 배양액보다 난관 상피세포를 첨가한 배양액에서 배양한 것이 유의적 (P＜0.05)으로 높은 발달율을 보였다. 2. 동결보호제에 대한 평형시간이 l분, 2분 및 3분일 때, 체외수정란의 생존율은 각각 82.9%, 73.3% 및 32.1%로서, 평형시간이 1분과 2분일 때의 생존율이 3분 동안 평형한 수정란보다 생존율이 유의적 (P＜0.05)으로 높았으며, 3분 동안 평형시에는 수정란의 생존율에는 치명적이었다. 배반포 수정란을 동결보존한 후의 생존율은 72.7%였으며, 상실배는 33.3% 가 생존하여 상실배보다는 배반포 수정란의 생존율이 유의적 (P＜0.05)으로 높게 나타났다. 3. 배반포 수정란을 105두의 수란우에 이식한 결과, 임신우 49두(46.7%)가 임신되었으며, 그 중에서 12.2% (6/49) 의 유산율과 6.1%(3/49)의 사산율을 보였고, 최종 40두(81. 7%)가 분만하였다. 이러한 결과로 보아 난포란의 체외배양 시 이식가능한 체외수정란의 생산율은 25%로서, 이는 난소 한개당 2.7개의 체외수정란 생산을 나타낸다. 생산된 수정란을 수란우에 이식한 결과 46.7% 의 임신율을 보여 향후 안정적인 쌍자 분만을 위해서 한우 수정란을 젖소의 대리모를 이용하는 방안에 대해 더욱 연구해 보아야 할 것으로 사료된다.