• Applied Biological Chemistry
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• 제40권6호
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• pp.495-500
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• 1997

Cyclodextrin을 합성하는 효소 CGTase를 호염기성 Bacillus sp. E1으로부터 분리하기 위하여 PCR을 실시하였다. PCR을 위하여 합성한 primer의 염기서열은 현재까지 보고된 CGTase 유전자의 염기서열을 비교 분석하여 가장 높게 보존된 영역을 찾아내어 선택하였다. PCR 증폭 결과 1.2 kbp 크기의 DNA 절편을 얻을 수 있었고 이를 molecular probe로 이용하여 Southern blot 분석을 실시하였다. Southern blot 분석결과 CGTase 유전자는 염색체 DNA를 제한효소 XbaI으로 절단한 5.3 kbp 절편내에 존재한다는 사실을 알아내었다. CGTase 유전자를 분리하기 위하여 유전자 은행을 제조한 후 선별작업을 실시하여 genomic clone인 pCGTE1을 얻을 수 있었다. pCGTEl의 염기서열을 결정한 결과 분리한 CGTase 유전자는 2109 bp의 open reading frame을 가지며 이는 703개의 아미노산으로 구성된 단백질을 coding하는 것으로 나타났다. 아미노산 서열의 유사성을 비교한 결과 Bacillus sp. KC201의 CGTase 와 가장 높은 94.3% 동질성을 나타내었다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제43권9호
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• pp.1388-1393
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• 2014

선행연구에서 얻은 alkalophilic Bacillus I-5 유래의 CGTase wild-type과 가수분해능이 강화된 mutant 효소를 활용하여 waxy rice starch로부터 아밀로펙틴 클러스터를 제조하였다. SEC-MALLS-RI 분석법으로 CGTase wild-type과 mutant 효소가 처리된 시료의 평균 분자량을 확인한 결과 10분가량의 효소반응으로 두 반응 모두 평균 분자량은 $10^4{\sim}10^5Da$으로 급격히 감소하였음을 확인하였으며, 일정 반응 시간이 경과한 이후에는 더 이상 분자량의 감소가 일어나지 않음으로 미루어 시료가 아밀로펙틴 클러스터 단위로 분해되었으며 그 분자량은 $10^4{\sim}10^5Da$ 정도임을 알 수 있다. 또한 MALDI-TOF/MS 분석을 통하여 CGTase wild-type은 다양한 종류의 cyclic 형태의 maltodextrin을 생성하고 있으며 mutant 효소는 주로 소량의 maltooligosaccharide 들을 생산함을 확인하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제9권6호
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• pp.811-819
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• 1999

The ${\beta}-CGTase$ gene of alkalophilic Bacillus firmus var. alkalophilus was cloned into E. coli using $pZErO^{TM}-2$ as a vector. The cloned gene encoded a total of 710 amino acid residues consisting of 674 amino acids of the matured protein and 36 amino acids of the signal peptide, including 20 amino acids from the lacZ gene in the vector. Although the cloned ${\beta}-CGTase$ gene did not contain the promoter and start codons, it was expressed by the lac promoter and lacZ start codon in the $pZErO^{TM}$ vector. A comparison was made with the amino acid sequence and ten other CGTases from Bacillus sp. Also, ten highly conserved regions, which are important amino acid residues in catalysis of CGTase, were identified. The lac promoter used for expression of the ${\beta}-CGTase$ gene was induced constitutively in recombinant E. coli even without IPTG possibly because of a lack of the lacI gene in both host and vector, repressing the lacZ gene in the lac operon. Its expression was catabolically repressed by glucose, however, its repression was reduced by soluble starch, mainly because of the extremely high increase of the cAMP level. ${\beta}-CGTase$ can be overproduced in the recombinant E. coli by maintaining intracellular cAMP levels mostly through the intermittent feeding of glucose during cultivation.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제26권2호
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• pp.122-129
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• 1998

최근 생물방제균으로 주목받고 있는 Enterobacter cloacae의 방제기작이 이 균에 의해 토양내에서 생산된 휘발성 ammonia이며 ammonia의 생산에는urease가 관계한다는 보고를 근거로 하여, 항생물질 생산성 균주로 선발된 우수한 길항균주에 암모니아 생성능, 즉 urease 유전자를 유전적으로 부가함으로써 항진균성 길항물질 생산과 암모니아 생산이 동시에 이루어 질 수 있는 새로운 다기능의 생물방제균을 유전적으로 육종하고자 하였다. 저병해 인삼경작지로부터 식물근부균 Fusarium solani의 생육을 강하게 억제하는 길항세균 한 균주 SH14균주를 분리, 선발하였으며, 분리된 균주를 동정한 결과 Bacillus subtilis이거나 그 근연종으로 추정되었다. 억제기작 실험을 통해 길항균주 B. subtilis SH14에 의해 생산되는 항진균성 길항물질은 외막가수분해효소와 같은 고분자 물질이 아니라 열에 안정한 저분자의 항생물질임을 알 수 있었다. 한편 ammonia 생산을 위한 urease의 유전자는 urease 생산력이 강력한 호알칼리성 Bacillus pasteurii의 urease 생산유전자를 E. coli-Bacillus shuttle vector인 pEB203에 subcloning하였고, 이어서 pGU 366으로 명명된 이 recombinant plasmid를 선발된 항진균성 길항균주 B. subtilis SH14에 PEG-induced protoplast transformation 방법으로 도입, 발현시켰으며, 최적조건을 조사하여 90분간의 lysozyme 처리과정 후 1.5 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$의 DNA와 40% PEG4000의 첨가로 약 6.5$\times$$10^{-4}$의 형질전환율을 얻을 수 있었다. 아울러 암모니아 생성능이 부가된 생물방제균 B. subtilis SH14(pGU366)에 의해 식물근부균 F. solani에 대한 생육억제력이 증가되는지 여부를 억제거리 측정법과 균체중량법을 통해 확인한 결과 urease 유전자가 도입된 형질전환체 B. subtilis SH14(pGU366)의 근부균 생육억제능이 각각 36.7%, 44.0%정도로 숙주균주인 B. subtilis SH14에 비해 근부균 생육억제능을 보다 강하게 나타내었음을 알 수 있었다. 따라서 항진균성 항생물질 생산성 생물방제균 B. subtilis SH14에 외부의 urease유전자를 도입하여 ammonia 생성능을 부가함으로써 생물방제력의 상승효과를 거둘 수 있었다.