• Toxicological Research
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• 제32권1호
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• pp.81-87
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• 2016

Aflatoxin B1 (AFB1) is produced by Aspergillus flavus growing in feedstuffs. Early detection of maize contamination by aflatoxigenic fungi is advantageous since aflatoxins exert adverse health effects. In this study, we report the development of an optimized conventional PCR for AFB1 detection and a rapid, sensitive and simple screening Real-time PCR (qPCR) with SYBR Green and two pairs of primers targeting the aflR genes which involved aflatoxin biosynthesis. AFB1 contaminated maize samples were divided into three groups by the toxin concentration. Genomic DNA was extracted from those samples. The target genes for A. flavus were tested by conventional PCR and the PCR products were analyzed by electrophoresis. A conventional PCR was carried out as nested PCR to verify the gene amplicon sizes. PCR-RFLP patterns, obtained with Hinc II and Pvu II enzyme analysis showed the differences to distinguish aflatoxin-producing fungi. However, they are not quantitative and need a separation of the products on gel and their visualization under UV light. On the other hand, qPCR facilitates the monitoring of the reaction as it progresses. It does not require post-PCR handling, which reduces the risk of cross-contamination and handling errors. It results in a much faster throughout. We found that the optimal primer annealing temperature was $65^{\circ}C$. The optimized template and primer concentration were $1.5{\mu}L\;(50ng/{\mu}L)$ and $3{\mu}L\;(10{\mu}M/{\mu}L)$ respectively. SYBR Green qPCR of four genes demonstrated amplification curves and melting peaks for tub1, afIM, afIR, and afID genes are at $88.0^{\circ}C$, $87.5^{\circ}C$, $83.5^{\circ}C$, and $89.5^{\circ}C$ respectively. Consequently, it was found that the four primers had elevated annealing temperatures, nevertheless it is desirable since it enhances the DNA binding specificity of the dye. New qPCR protocol could be employed for the determination of aflatoxin content in feedstuff samples.

• Applied Biological Chemistry
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• 제13권1호
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• pp.35-42
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• 1970

한국의 경기, 충청, 강원, 전라 및 경상도에서 각각 한개씩 취한 5개의 한국 재래식 메주의 발효 미생물을 분류 및 생태학적 견지에서 조사 연구한바 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 발효 미생물중 molds는 메주 덩어리의 표면층의 부분에만 존재하며 그 종류는 잡다하여 주요 균종을 알아낼 수는 없었으나 본 실험에서는 3종의 Mucor, 2종의 Penicillium, 각 1종의 Scopulariosis 및 Aspergillus를 분리할 수 있었다. 2. 발효 미생물중 bacteria는 메주덩어리 전체에 골고루 조밀하게 분포되어 있었으며 특히 덩어리 내부에는 bacteria만이 존재하였다. Bacteria의 균종은 단순하여 Bacillus subtilis와 Bacillus pumilus가 한국 메주의 거의 전 bacteria군을 형성하고 있어 한국 메주의 발효 숙성은 bacteria군의 발효에 의한 것이 그 특색이 아닌가 생각되었다. 한국 메주에서는 그외에 Staphylococcus의 1종도 분리되었다. 3. 5개의 메주 시료중 2개의 메주 시료에서는 Rhodotorula flava 및 Torulopsis dattila의 2종의 yeasts가 분리되었으나 이들 yeasts가 메주의 발효 미생물군 형성에 괼요한 것인지의 여부는 아직 분명치 않았다. 4. 한국 재래식 메주는 그 부피의 약 1/2을 차지 하늘 덩어리의 표면층의 부분과 내부부분에있어서 발효 미생물의 생태가 다르며 따라서 이들 발효미생물에 의한 메주의 발효 숙성에 따른 화학적인 변화도 이 두 부분이 서로 상이하여 숙성된 메주는 그 질이 이 두 부분에 있어서 다르다고 인정되었다. 즉 메주의 외측부분은 견고하게 건조하여 삶은 콩이 그리 변질되지 않았으나 메주내부는 삶은콩이 세균에 의하 연하고 끈끈하고 암갈색으로 심하게 변하였다. 5. 한국 재래식 메주 5재 시료중 한개 시료에서만 Aspergillus oryzae가 분리되었으며 그 생육밀도도 ${\sim}10^4/g$의 희박한 것이고 또 이 mold가 자랄수 있는 것은 메주 덩어리의 표면 층 뿐이므로 한국재래식 메주에 있어서는 이 mold가 생산하는독소 aflatoxin은 일본식 메주의 경우처럼 심각한 문제가 되지는 않는다고 생각되었다.