• Archives of Pharmacal Research
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• 제22권5호
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• pp.485-490
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• 1999

The mechanism of action of fish oil (FO), currently used in different chronic inflammatory conditions such as rheumatoid arthritis (RA), is not completely understood, although it is thought that it could alter the metabolism of endogenous autacoids. In addition, we hypothesized that the known capability of fatty acids (FA) of stabilizing serum albumin and perhaps other proteins, may be of pharmacological relevance considering that it is shared by other anti-rheumatic agents (e.g. nonsteroidal antiinflammatory drugs). Thus, we studied the effect of oral administration of FO and corn oil (CO), a vegetable oil with a different composition, on the stability of rat serum proteins, evaluated buy a classical in vitro method based on heat-induced protein denaturation. FO, and, to a lower extent, CO inhibited heat-induced denaturation of rat serum (RS): based on the inhibitory activity (EC50) of the major fatty acids against heat-induced denaturation of RS in vitro, it was possible to speculate the in vivo effects of palmitic acid (C16:0) and eicosapentaenoic acid (EPA, C20:5, n-3) may be more relevant than that of linolenic acid (C18:2). To better investigate this phenomenon, we extracted albumin from the serum of animals treated or not with FO with a one-step affinity chromatography technique, obtaining high purity rat serum albumin preparations (RSA-CTRL and RSA-FO), as judged by SDS-PAGE with Coomassie blue staining. When these RSA preparations were heated at $70^{\circ}C$ for 30 min, it was noted that RSA-FO was much more stable than RSA-CTRL, presumably due to higher number of long chain fatty acids (FA) such as palmitic acid or EPA. In conclusion, we provided evidences that oral administration of FO in the rat stabilizes serum albumin, due to an increase in the number of protein bound long chain fatty acids (e.g. palitic acid and EPA). We speculate that the stabilization of serum albumin and perhaps other proteins could prevent changes of antigenicity due to protein denaturation and glycosylation, which may trigger pathological autoimmune responses, suggesting that this action may be involved in the mode of action of FO in RA and other chronic inflammatory diseases.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제22권3호
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• pp.292-300
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• 2012

We report the expression, purification, and characterization of L-asparaginase (AnsA) from Rhizobium etli. The enzyme was purified to homogeneity in a single-step procedure involving affinity chromatography, and the kinetic parameters $K_m$, $V_{max}$, and $k_{cat}$ for L-asparagine were determined. The enzymatic activity in the presence of a number of substrates and metal ions was investigated. The molecular mass of the enzyme was 47 kDa by SDS-PAGE. The enzyme showed a maximal activity at $50^{\circ}C$, but the optimal temperature of activity was $37^{\circ}C$. It also showed maximal and optimal activities at pH 9.0. The values of $K_m$, $V_{max}$, $k_{cat}$, and $k_{cat}/K_m$ were $8.9{\pm}0.967{\times}10^{-3}$ M, $128{\pm}2.8$ U/mg protein, $106{\pm}2s^{-1}$, and $1.2{\pm}0.105{\times}10^4M^{-1}s^{-1}$, respectively. The L-asparaginase activity was reduced in the presence of $Mn^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Ca^{2+}$, and $Mg^{2+}$ metal ions for about 52% to 31%. In addition, we found that $NH_4{^+}$, L-Asp, D-Asn, and ${\beta}$-aspartyl-hydroxamate in the reaction buffer reduced the activity of the enzyme, whereas L-Gln did not modify its enzymatic activity. This is the first report on the expression and characterization of the L-asparaginase (AnsA) from R. etli. Phylogenetic analysis of asparaginases reveals an increasing group of known sequences of the Rhizobial-type asparaginase II family.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제26권11호
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• pp.1881-1890
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• 2016

Manganese superoxide dismutase (MnSOD) is a vital enzyme that protects cells from free radicals through eliminating superoxide radicals ($O^{2-}$). Hirudin, a kind of small active peptide molecule, is one of the strongest anticoagulants that can effectively cure thrombus diseases. In this study, we fused Hirudin to the C terminus of human MnSOD with the GGGGS linker to generate a novel dual-feature fusion protein, denoted as hMnSOD-Hirudin. The hMnSOD-Hirudin gene fragment was cloned into the pET15b (SmaI, CIAP) vector, forming a recombinant pET15b-hMnSOD-Hirudin plasmid, and then was transferred into Escherichia coli strain Rosetta-gami for expression. SDS-PAGE was used to detect the fusion protein, which was expected to be about 30 kDa upon IPTG induction. Furthermore, the hMnSOD-Hirudin protein was heavily detected as a soluble form in the supernatant. The purification rate observed after Ni NTA affinity chromatography was above 95%. The hMnSOD-Hirudin protein yield reached 67.25 mg per liter of bacterial culture. The identity of the purified protein was confirmed by western blotting. The hMnSOD-Hirudin protein activity assay evinced that the antioxidation activity of the hMnSOD-Hirudin protein obtained was $2,444.0{\pm}96.0U/mg$, and the anticoagulant activity of the hMnSOD-Hirudin protein was $599.0{\pm}35.0ATU/mg$. In addition, in vitro bioactivity assay showed that the hMnSOD-Hirudin protein had no or little cytotoxicity in H9c2, HK-2, and H9 (human $CD_4{^+}$, T cell) cell lines. Transwell migration assay and invasion assay showed that the hMnSOD-Hirudin protein could suppress human lung cancer 95-D cell metastasis and invasion in vitro.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제16권10호
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• pp.1529-1536
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• 2006

We cloned a gene of ompH(D:4) from pigs infected with P. multocida D:4 in Korea [16]. The gene is composed of 1,026 nucleotides coding 342 amino acids (aa) with a signal peptide of 20 aa (GenBank accession number AY603962). In this study, we analyzed the ability of the ompH(D:4) to induce protective immunity against a wild-type challenge in mice. To determine appropriate epitope(s) of the gene, one full and three different types of truncated genes of the ompH(D:4) were constructed by PCR using pET32a or pRSET B as vectors. They were named ompH(D:4)-F (1,026 bp [1-1026] encoding 342 aa), ompH(D:4)-t1 (693 bp [55-747] encoding 231 aa), ompH(D:4)-t2 (561 bp [187-747] encoding 187 aa), and ompH(D:4)-t3 (540 bp [487-1026] encoding 180 aa), respectively. The genes were successfully expressed in Escherichia coli BL21(DE3). Their gene products, polypeptides, OmpH(D:4)-F, -t1, -t2, and -t3, were purified individually using nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) affinity column chromatography. Their $M_rs$ were determined to be 54.6, 29, 24, and 23.2 kDa, respectively, using SDS-PAGE. Antisera against the four kinds of polypeptides were generated in mice for protective immunity analyses. Some $50{\mu}g$ of the four kinds of polypeptides were individually provided intraperitoneally with mice (n=20) as immunogens. The titer of post-immunized antiserum revealed that it grew remarkably compared with pre-antiserum. The lethal dose of the wild-type pathogen was determined at $10{\mu}l$ of live P. multocida D:4 through direct intraperitoneal (IP) injection, into post-immune mice (n=5, three times). Some thirty days later, the lethal dose ($10{\mu}l$) of live pathogen was challenged into the immunized mouse groups [OmpH(D:4)-F, -t1, -t2, and -t3; n=20 each, two times] as well as positive and negative control groups. As compared within samples, the OmpH(D:4)-F-immunized groups showed lower immune ability than the OmpH(D:4)-t1, -t2, and -t3. The results show that the truncated-OmpH(D:4)-t1, -t2, and -t3 can be used for an effective vaccine candidate against swine atrophic rhinitis caused by pathogenic P. multocida (D:4) isolated in Korea.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제40권3호
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• pp.274-277
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• 2012

본 연구에서는 다제내성을 보이는 인체 병원균의 하나인 S. aureus에서 유래된 FtsZ 단백질의 유전자를 클로닝하고 대장균에 형질전환하여 재조합 단백질을 만들고, in vitro 상에서 폴리머 형성 활성을 측정하였다. Bradford 방법을 이용하여 SA FtsZ단백질의 농도를 측정한 후, SA FtsZ단백질의 폴리머 형성 활성을 확인하기 위해 형광계를 이용하여 excitation 방향과 $90^{\circ}$의 방향에서 산란되는 빛의 양을 측정하는 방법을 사용하였을 때에 대조군에서는 빛이 산란되지 않았고, SA FtsZ 단백질에 GTP와 $Mg^{2+}$를 처리한 실험군에서만 빛이 산란되는 현상을 관찰하였다. 1분여의 시간이 지난 이후에는 다시 산란되는 빛이 줄어드는 것을 볼 수 있는데, 이것은 SA FtsZ 단백질의 아미노말단 도메인의 GTPase 활성에 의해서 GTP가 분해되어서 SA FtsZ 단백질의 폴리머가 단량체로 분해되었기 때문이라고 예측된다. 본 연구를 통하여 확립된 SA FtsZ 활성 측정 방법은 향후 SA FtsZ 단백질의 폴리머 형성을 저해하는 방식으로 S. aureus를 표적으로 하는 항생제 후보물질 도출을 위한 스크리닝 방법으로 사용될 수 있을 것이다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제22권2호
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• pp.176-183
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• 2012

Eukaryotic translation termination is governed by eRF1 and eRF3. eRF1 recognizes the stop codons and then hydrolyzes peptidyl-tRNA. eRF3, which facilitates the termination process, belongs to the GTPase superfamily. In this study, the effect of the MC domain of eRF1a (eRF1aMC) on the GTPase activity of eRF3 was analyzed using fluorescence spectra and high-performance liquid chromatography. The results indicated eRF1aMC promotes the GTPase activity of eRF3, which is similar to the role of eRF1a. Furthermore, the increased affinity of eRF3 for GTP induced by eRF1aMC was dependent on the concentration of $Mg^{2+}$. Changes in the secondary structure of eRF3C after binding GTP/GDP were detected by CD spectroscopy. The results revealed changes of conformation during formation of the eRF3C GTP complex that were detected in the presence of eRF1a or eRF1aMC. The conformations of the eRF3C eRF1a GTP and eRF3C eRF1aMC GTP complexes were further altered upon the addition of $Mg^{2+}$. By contrast, there was no change in the conformation of GTP bound to free eRF3C or the eRF3C eRF1aN complex. These results suggest that alterations in the conformation of GTP bound to eRF3 is dependent on eRF1a and $Mg^{2+}$, whereas the MC domain of eRF1a is responsible for the change in the conformation of GTP bound to eRF3 in Euplotes octocarinatus.

• 한국가축번식학회지
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• 제15권1호
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• pp.67-77
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• 1991

本 試驗은 受精初期段階에서 생쥐卵子 透明帶의 機能을 糾明하고 種特異的인 精子受容體의 存在 및 構造理解를 위한 基礎硏究로서 ICR 생쥐의 透明帶를 免疫原으로 하여 토끼에서 抗透明帶抗體를 生産하고 免疫分析法 및 生物學的 檢査法으로 生産된 抗體가 생쥐 透明帶에 特異性이 있음을 確認한 후 이 抗體가생쥐 未受精卵의 體外受精에 미치는 影響과 또 이 抗體를 생쥐에 受動免疫하였을 때 受精에 미치는 影響을 調査하였던 바 다음과 같은 結果를 얻었다. 1. 處理區로서 抗血淸을, 對照區로서 對照血淸을 卵子培養液에 各各 0.3~10%로 含有한 培養液에서 생쥐의 未受精卵을 2時間 培養한 後 觀察하였을 때 對照區 卵子들의 透明帶가 正常的인 形態를 나타내었던 反面에, 處理區의 卵子들은 모두 透明帶 表面에 뚜렷한 沈澱層을 나타내었다. 이어 對照區와 處理區의 卵子를 0.1% pronase가 含有된 培養液으로 옮긴 후 觀察하였을 때, 對照區 卵子들의 透明帶가 5~7分만에 完全히 融解한 反面에, 處理區에서는 2~3時間까지 殘存하였다. 2. 處理區와 對照區 卵子를 FITC-goat anti-rabbit IgG가 含有된 培養液에서 養液한 후 螢光顯微鏡下에서 觀察하였을 때 對照區에서 對照血淸을 10% 含有한 培養液에서 培養한 일부 卵子들의 透明帶에서 희미한 螢光이 나타났으나 血淸稀釋度가 增加함에 따라 전혀 螢光을 나타내지 않았던 反面에, 處理區에서는 抗血淸이 1 : 1,000으로 含有된 培養液에서 培養한 卵子의 透明帶에서도 강한 螢光이 나타났다. 3. 帶抗體를 抗原으로 하여 間接酵素免疫分析法을 實施하였을 때 抗血淸과 對照血淸이 PBS에 1 : 200까지 稀釋되었을 때의 O.D.價는 별다른 差異를 나타내지 않았으나 血淸의 稀釋度가 增加함에 따라 O.D.價가 有意한 差異를 나타냄으로써 透明帶에 特異性을 갖는 抗體임을 確認할 수 있었다. 4. 抗血淸과 對照血淸이 各各 0.3~10%까지 含有된 培養液으로 생쥐의 未受精卵을 豫備培養한 다음 體外受精을 實施하였을 때의 受精率은 對照區에서 77.7%~87.7%이었던 反面에, 處理區에서는 0~29.8%로서 抗透明帶抗體가 생쥐卵子의 體外受精을 完全히 또는 顯著히 抑制하였다. 그러나 抗血淸과 對照血淸이 各各 2.5~10%까지 含有된 培養液으로 透明帶를 除去한 未受精卵의 體外受精을 하였을 때의 受精率은 處理區와 對照區에서 各各 93.0~98.3% 및 93.3~94.3%로서 受精抑制現象을 나타내지 않았다. 5. 抗血淸과 正常血淸, 그리고 兩 血淸으로부터 protein A-affinity chromatography에 의해 分離한 immunoglubulin G를 各各 생쥐에 受動免疫하였을 때, 對照區로서 對照血淸을 0.1~0.3ml 또는 control IgG를 1~3ml 投與했을 때의 各各의 受精率이 80.4~90.2%, 82.2~94.4%이었던 反面에, 處理區로서 抗血淸을 0.3ml 또는 immune IgG를 3mg 投與한 생쥐에서는 完全한 受精抑制現象이 確認되었다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제35권5호
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• pp.375-381
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• 1992

Streptomyces sp. S34가 분비하는 exoinulase의 생산조건을 검토하고 정제하였으며 이 호소의 성질을 조사하여 Streptomyces sp. S56이 생산하는 endoinulase와 비교하였다. 이 효소는 같은 속에서 분비되는 endoinulase와는 달리 탄소원으로 inulin이외에 glucose 및 soluble starch를 사용할 때도 효소가 생산되어 구성효소로 생각되었으며 유기질소원으로 대두박을 사용할 때 최대의 효소생산을 보였다. DEAE-cellulose에 이어 Sephadex G-200 chromatography로 정제한 효소의 최적 pH는 $5.5{\sim}6.0$이었고 최적온도 $50^{\circ}C$에서의 열안정성은 1시간 처리로 45%의 잔류활성이 있었다. 효소활성은 $Mn^{+2}$ 이온에 의하여 증가되나 $Ag^+$, $Hg^{+2}$, $Fe^{+3}$ 이온들에 의하여는 80% 이상 감소되었으며 특히 EDTA, 8-hydroxyquinoline에 의해 저해되어 metalloenzyme으로 생각되었다. 본 효소는 inulase 활성 대 invertase 활성비가 0.52로 전형적인 exoinulase로서 inulin 및 sucrose에 대한 친화도는 거의 같으나 최대속도는 inulin이 기질일 경우 sucrose보다 약 10배 빨랐다. 같은 Streptomyces 속에서 분비되는 endoinulase와 비교하면 작용 pH 범위가 $5{\sim}7$로 더 좁고 열안정성도 낮으며 저해 금속이온도 상이하나 두 효소 모두 metalloenzyme으로 추정되었다.

• 미생물학회지
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• 제32권2호
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• pp.147-154
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• 1994

Serratia marcescens가 세포외로 분비하는 nuclease의 유전자가 발현된 Escherichia coli JM107을 배양하여 다량의 효소를 정제하였다. Matrex green gel과 heparin agarose gel column chromatography법으로 약 50배 정제한 효소는 분자량이 29KDa였으며, 전기영동 상에서 단일 띠를 보였다. 이 단백질을 이용하여 polyclonal antibody를 만들고, 면역조직화학법으로 세포내의 분포를 조사하였다. Nuclease는 주로 세포막에 존재하였고, 이를 토대로 효소가 세포질에서 합성된 후 세포막으로 빠르게 이동함을 알 수 있었다. 이 결과는 세포의 막분획에서 효소의 활성의 대부분이 회수되며, 면역블럿 방법으로 효소의 대부분이 세포막에서 검출된다는 결과와 일치하였다.

• 한국수산과학회지
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• 제24권5호
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• pp.273-288
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• 1991

연골어류와 경골어류의 진화에 관한 생리생화학적 차이를 특정한 소화효소의 성질과 구조면에서 밝혀 보고자 본 연구를 시도하였다. 양 어종을 대표하는 종류로서 복상어와 고등어를 시료로 선정하고, 소화효소 중 trypsin을 대상으로 하여, 우선 그 정제방법의 확립, 분자량의 측정, 반응 및 안정성에 미치는 pH 및 온도의 영향, 그리고 금속이온과 화학약제가 반응에 미치는 영향 등을 분석 검토하였으며, 그 내용을 요약하면 다음과 같다. 1. 정제방법에 관하여, 민저 복상어 trypsin은 4 염화탄소로서 탈지 추출한 조효소에 대하여 $50-70\%$ 포화 황산암모늄 염석, DEAE-Sephadex A-50칼럼 크로마토그래피, benzamidine-Sepharose 6B, 친화성 크로마토그래피, Sephadex G-75-120 겔 여과법을 거쳐 disc- 전기영동법, SDS-PAG 전기영동법 및 겔 여과법상 균질상태로 얻었다. 또, 고등어의 trypsin은 역시 4염화탄소로서 탈지 추출한 조효소에 대하여 $30-70\%$포화 황산암모늄 염석, benzamidine-Sepharose 6B 친화성 크로마토 그래피, DEAE-Sephadex A-50 크로마토그래피 등의 재크로마토그래피, benzamidine-Sepharose 6B에 의한 재크로마토그래피 등의 정제과정을 거쳐 disc- 전기영동법, SDS-PAG 전기영동법 및 겔 여과법으로 균질의 가칭 trypsin-A와 B를 달리하였다. 2. 이들 유래를 달리하는 각 trypsin의 분자량은 SDS-PAG 전기영동법으로 측정했을 때, 복상어 trypsin 31,700, 고등어 trypsin-A 30,000, 고등어 trypsin-B 29,000, 그리고 겔 여과법으로 측정했을 때, 복상어 21,500, 고등어 trypsin-A 23,700, 고등어 trypsin-B 21,500이었다. 3. 이들 효소들의 알맞은 반응조건은 복상어 trypsin pH 9.0, $45-50^{\circ}C$, 고등어 trypsin-A와 B pH 8.0, $50^{\circ}C$였다. pH와 온도조건에 따른 안정성을 각각 pH와 온도조건별로 30분간 전처리한 후에 그 활성에 미치는 영향으로 비교해 본 결과, pH의 변화에 대하여는 복상어 trypsin은 pH 10.0에서, 그리고 고등어 trypsin-A는 pH 7.0-9.0에서, 고등어 trypsin-B는 pH 8.0에서 안정하였고, 온도조건에 대하여는 복상어 trypsin은 $25^{\circ}C$까지, 그리고 고등어는 trypsin-A가 $10^{\circ}C$까지, 고등어 trypsin-B는 $35^{\circ}C$까지는 안정하였으나, 그 이후부터는 불안정하였다. 4. 이들 효소들은 공통적으로 금속이온 Ag^{2+},\;Cu^{2+}$ 및 $Hg^{2+}$에 의하여 저해를 받았으며, 그 저해의 정도는 고등어 trypsin-A와 B가 보다 심하게 받았다. 또 이들 효소들은 antipain, leupeptin, TLCK(to-syllysine chloromethyl ketone) 및 SBTI(soybean trypsin inhibitor)에 의하여 현저한 저해를 받았고, PMSF(phenylmethane sulfonylfluoride), DFP(diisopropyl fluorophosphate) 및 benzamidine에 의하여 어느정도 저해를 보여 모두 serine-계의 trypsin임을 뒷받침하였다