• Applied Biological Chemistry
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• 제41권5호
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• pp.355-362
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• 1998

병아리콩 근류의 호스트부분에서 플라스티드에 존재하는 것으로 추정되는 포스포프룩토오스 키나아제(EC 2.7.1.11; PFK)을 순수분리 정제하고, 정제된 단백질 분자량이 220 kDa인 비당단백질(N-linked)이다. SDS-PAGE와 Western blot의 결과는 정제된 효소가 4개의 55 kDa subunit로 이루어져 있음을 지적하고 있다. 이 효소는 pH 8에서 최적활성으로 날카로운 곡선을 나타내고 있으며, 최적 pH 8과 생리적으로 비슷한 pH 7에서 Fru-6-P 및 nucleoside triphosphate 기질에 Michaelis-Menten kinetics을 나타냈다. MgATP가 뉴크레오 삼인산중에 가장 효율적인 인산기 공여체로서 나타냈다. 포스포엔롤피루베이트는 마이너 형태의 PFK 활성에 가장 강력한 억제자이며, 또한 이 효소는 3-포스포글리세레이트와 2-포스포글리세레이트에 의해 강하게 억제된다. 마이너 형태의 PFK는 KCl, NaCl등 Pi에 의해 약하게 활성이 증진되지만, 높은 농도에서는 억제자로서 작용한다.

• BMB Reports
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• 제32권6호
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• pp.567-572
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• 1999

We have previously shown that a DNA fragment is responsible for the anticoagulatory effect of an earthworm, Lumbricus rubellus. The anticoagluant increased the activated partial thromboplastin time (APTT) and also inhibited the thrombin activity observed with either N-${\alpha}$-p-tosyl-L-arginine methyl ester (TAME) or H-D-phenyl-alanyl-L-pipecoil-L-arginine-p-nitroanilide (S-2238). Since trypsin digestion of the anticoagulant further increased the APTT, the possible presence of a regulatory protein for the anticoagulatory DNA was investigated by digesting the anticoagulant with trypsin and isolating the DNA fragment with C4-reversed phase HPLC. The DNA fragment lacking a regulatory protein was eluted in the flow-through fraction, and analyzed with thrombin and activated factor X. Activated factor X activity was more strongly inhibited than thrombin activity. For DNA digestion, we treated the anticoagulant with DNase and purified the DNA-binding protein with a FPLC Resource-S cation exchange column. The regulatory protein, with an $M_r$ of 55.0 kDa, reduced the anticoagulatory effect of the DNA fragment.

• Applied Biological Chemistry
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• 제51권4호
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• pp.299-304
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• 2008

A ${\beta}$-1,4-endoglucanase gene from Bacillus subtilis H12 was cloned into Escherichia coli JM109 (pBC8) and sequenced. The endoglucanase gene with an insert DNA of 2.5 kb possessed an open reading frame of 1,500 bp encoding a mature protein of 499 amino acids with a calculated molecular mass of 55 kDa. The deduced amino acid sequence showed similarity to those of the known neutral cellulase genes of B. subtilis PAP115 (99.2%) and BSE616 (97.8%), as well as the alkaline gene of Bacillus sp. N4 (55.1%). The endoglucanase activity expressed by E. coli (pBC8) was localized in the periplasmic fraction (80%) and the cytoplasmic fraction (20%). An endoglucanase was purified from the periplasmic fraction by performing gel filtration and anion exchange chromatography. The molecular weight of the purified enzyme was estimated to be 31 kDa by SDS-PAGE, and the maximum activity occurred at pH 7 and $40^{\circ}C$. The enzyme easily hydrolyzed soluble substrates such as carboxymethyl cellulose and barely ${\beta}$-glucan, whereas the sigmacell and xylan, the known insoluble substrates, were not entirely hydrolyzed.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제33권2호
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• pp.96-105
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• 2005

공시균인 S. longwoodensis IFO 14251의 autoregulators 및 receptor gene 탐색의 일환으로 기존의 Streptomyces속 receptor gene의 공통배열을 primer로 이용하여 PCR을 수행하였다. 예상되는 100 bp 크기의 단편을 pUC19 vector에 ligation하여 E. coli $DH5{\alpha}$에 transformation한 후, plasmid를 분리하여 BamHI을 처리하여 $2\%$ agarose gel에 전기영동한 결과, pUC19 외에 receptor gene PCR product가 100 bp 위치에 존재하는 것을 확인하였다. 형질전환된 plasmid로 PCR을 수행한 후, 염기배열을 결정하여 분석한 결과, Streptomyces sp. 유래의 receptor gene의 일부분임이 확인되었다. 따라서 S. longwoodensis IFO 14251에는 lysocellin 생산에 관여한다고 추정되는 autoregulator receptor protein을 코드하는 유전자가 존재할 것으로 예상되어 100 bp의 PCR product를 probe로 이용하여 Southern 및 colony hybridization을 통하여 4.4 kb의 SphI 단편을 가지는 plasmid(pSLT)를 제작하였고 이를 sequencing한 결과, Streptomyces 속 유래의 autoregulator receptor 단백질을 코드하는 유전자와 3개의 open reading frame(651 bp)을 확인하여 sltR이라 명명하였다. 유전자 해석 결과, 기존의 autoregulator receptor proteins과 비교시 $35{\sim}46\%$의 homology를 나타내었다. 재조합 단백질의 발현을 위해, sltR/pET-l7b plasmid를 제작하고 E. coli BL21(DE3)/pLysS을 host cell로 이용하여 재조합 단백질을 발현시켰다. SltR 재조합 단백질의 정제는 DEAE-Sephacel column chromatography와 DEAE-5PW chromatography(HPLC)를 통해 수행하였다. Gel filtration chromatography(HPLC, 55 kDa)와 SDS-PAGE(28 kDa)를 통해 분자량을 확인한 결과, 재조합 단백질은 dimer형태로 존재하는 것으로 확인되었다. 또한, 결합활성에 있어 A-factor type의 autoregulator에 대해 가장 강한 결합활성을 나타내었다.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제35권1호
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• pp.55-62
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• 1997

톡소포자충(ToxopLasmn gondii)은 다양한 항원을 가지고 있으며, 이들 항원의 분석은 세 포매개성 면역반응 및 톡소포자충증의 면역학적 진단방법의 연구에 매우 중요하다 본 연구는 톡소포자충의 여러 단백질중 대부분의 충주(strain)에 존재하는 분자량 30 kDa의 단백질을 단클론 항체를 이용하여 분리한 후. 30 kDa 항원의 면역학적 특성을 초음파 추출 조항원과 비교 평가하였다. 톡소포자충의 세포막 항원으로 면역한 마우스 비장세포와 마우스 Sp2/0-Agl4 골수종세포를 융합하여 8개의 단클론 항체를 Western blot으로 확인하였다 이들 단클론 항체는 높은 특이성을 보였으며, $IgG_{2b}가{\;}5개,{\;}IgG^{1}이{\;}2개,{\;}IgG_{2a}$가 1개였다. 간접형광항체법으로 충체내 위치를 관찰한 결과. 30 kDa 항원은 tachyzoite의 표면 세포막에 주로 분포하였다. 단클론 항체와 CNBr-activated Sepharose 4B를 coupling하여 만든 immunoafrnity chromatography를 이용 하여 30 kDa 항원을 분리하였다. 분리한 30 kDa 항원으로 자극시킨 마우스 복강대식세포의 $NO_2^{-}$ 생산량은 초음파 추출 조항원 사용군에 비해 유의하게 증가하였으나 대식세포의 탐식능은 유의한 차이가 없었다. 또한 ELISA로 톡소포자충증을 진단시, 톡소포자충 30 kDa 항원 사용군은 조항원 사용군에 비해 민감도의 변화는 없었으나 특이성은 증가하였다 이상으로 보아 톡소포자충 30 kDa 항원은 감염 방어 면역 효과가 있었으며 진단에 이용시 특이성을 더 높일 수 있었다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제43권10호
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• pp.1535-1542
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• 2014

어류 부산물인 명태 껍질에서 콜라겐을 추출하기 위하여 0.1 N NaOH로 알칼리 처리 후 pepsin으로 효소 처리하였고 저분자화를 위해 neutrase를 이용하여 분자량별로 콜라겐을 제조하였다. 콜라겐은 1 kDa 이하, 1~3 kDa, 3~10 kDa 및 10 kDa 이상으로 분자량별로 분리하여 이화학적 특성 및 생리활성을 조사하였다. 분자량에 따른 콜라겐 함량은 1 kDa 이하에서 36.43%로 가장 높았으며 유리 아미노산 조성은 1 kDa 이하, 1~3 kDa, 3~10 kDa 및 10 kDa 이상에서 각각 1,603.69, 1,000.55, 475.04, 415.73 mg/100 g으로 분자량이 작을수록 유리 아미노산의 함량이 높게 나타났다. 콜라겐의 분자구조를 Fourier transform infrared spectroscopy로 측정한 결과 분자량에 따른 콜라겐 모두 amide A, amide I, amide II, amide III의 범위에 wavenumber 속에 포함되었으며 콜라겐 표준품과 유사한 peak band 값을 나타내어 화학구조가 동일함을 알 수 있었다. 전자공여능과 superoxide dismutase 유사 활성은 1 kDa 이하에서 각각 29.51%, 38.45%로 가장 높았으며 분자량이 커질수록 그 값은 감소하였다. 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 ${\alpha}$-MSH를 첨가한 tyrosinase 활성 측정은 1 kDa 이하에서 농도 유의적으로 tyrosinase 활성을 저해시키는 것을 확인할 수 있었으며, 광노화에 의한 피부 주름 개선 효과는 HS68 cell을 이용하여 MMP-1 저해 활성을 측정하였고 그 결과 10 kDa 이상에서는 MMP-1 저해 활성이 나타나지 않았으나 3 kDa 이하에서는 MMP-1 저해 활성이 나타나 세포 보호 효과가 있음을 확인하였다. 콜라겐의 분자량은 항산화 활성 및 생리활성과 유의적인 상관관계를 나타내어 저분자 콜라겐은 기능성 식품 및 화장품 소재로서 활용 가능할 것으로 사료된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제23권4호
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• pp.446-453
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• 1995

$\alpha $-Arabinofuranosidase was produced by E. coli HB101 haboring the recombinant plasmid pKMG11 which contained the arfI gene of Bacillus stearothermophilus. The maximum production of the enzyme was observed when E. coli HB101 cells were grown at 37$\circ$C for 20 hours in the medium containing 0.5% arabinose, 1.0% tryptone, 0.5% yeast extract, and 1% NaCl. The $\ALPHA $-arabinofuranosidase produced was purified to homogeneity using a combination of 20-50% ammonium sulfate precipitation, DEAE-Sepharose CL-6B ion exchange column chromatography and Sepharose 6B-100 gel filtration. The purified enzyme was most active at 55$\circ$C and pH 6.5. The K$_{m}$ and V$_{max}$ values of the enzyme on $\rho $-nitrophenyl-$\alpha $-arabinofuranoside was determined to be 2.99 mM and 0.43 $\mu $mole/min (319.74 $\mu $mole/min/mg), respectively. The pI value was 4.5. The molecular weight of the native protein was estimated to be 289 kDa. The SDS-polyacrylamide gel clectrophoresis analysis suggested that the functional protein was a trimer of the 108 kDa identical subunits. The N-terminal amino acid sequence of the a-arabinofuranosidase was identified as X-Ser-Thr-Ala-Pro-Arg( \ulcorner )-Ala-Thr-Met-Val-Ile-Asp-X-Ala-Phe.

• 한국식품영양과학회지
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• 제46권4호
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• pp.435-441
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• 2017

갈색거저리유충 분말을 4%(w/v)의 기질용액으로 제조한 후, 기질대비 단백질 가수분해 효소(alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain, papain)를 각 1%(w/w) 첨가하여 갈색거저리 유충 단백가수분해물을 제조하였다. 24시간 반응시킨 각 효소별 가수분해물의 특성을 SDS-PAGE로 확인한 결과 alcalase 단백가수분해물의 가수분해가 우수함을 확인하였으며, available amino group의 농도는 flavourzyme, alcalase, neutrase 단백가수분해물 각각 $5,429.35{\mu}g/mL$, $4,781.39{\mu}g/mL$, $3,155.55{\mu}g/mL$의 값을 나타내 상대적으로 높은 가수분해도를 보였고, bromelain($1,800{\mu}g/mL$)과 papain($1,782.61{\mu}g/mL$)의 경우 상당히 낮은 값을 보였다. 가수분해도가 높게 나타난 3종의 단백가수분해물을 한외여과막을 통해 분자량이 3 kDa 이하로 분리한 후 동결 건조하였으며, 이 동결건조물을 이용하여 항산화 실험을 수행하였다. 갈색거저리 유충 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 alcalase 단백가수분해물의 $RC_{50}$값이 $339.34{\mu}g/mL$로 나타났고, flavourzyme 가수분해물 $379.35{\mu}g/mL$, neutrase 가수분해물 $398.93{\mu}g/mL$로 나타났으며, ABTS 라디칼 소거 활성은 neutrase 단백가수분해물의 $RC_{50}$값이 $29.84{\mu}g/mL$였고, alcalase $36.90{{\mu}g/mL$ 및 flavourzyme $56.03{\mu}g/mL$ 순으로 나타났다. Hydrogen peroxide 소거 활성은 alcalase 단백가수분해물의 $RC_{50}$값이 $65.97{\mu}g/mL$였고, flavourzyme $121.67{\mu}g/mL$ 및 neutrase $70.38{\mu}g/mL$의 값을 보였다. 상기 3가지 항산화 실험에서 우수한 항산화 활성을 보이며, 저분자 펩타이드 생산 효율이 가장 높았던(42.05%) alcalase 단백가수분해물을 이용해 linoleic acid에 대한 지질과산화 억제 활성을 측정한 결과, 6일 동안 $100{\sim}800{\mu}g/mL$의 농도에서 처리 농도에 의존적으로 유의적인 항산화능을 보였다.

• 수산해양교육연구
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• 제28권4호
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• pp.903-912
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• 2016

Hagfish which belongs to the chordate contact cyclostomata, is important phylogenetic relationship between vertebrate and invertebrate. Cathepsins of the cysteine protease family have traditionally been thought to play a major role in intracellular protein degradation and turnover in lysosomes. In this study, Catepsin L was cloned from Inshore hagfish (Eptatretus burgeri), the cDNA encoding ORF of the Eptatretus burgeri Cathepsin L (EbCtL) is 978 bp. The cDNA encoding proEbCtL was expressed in Escherichia coli strain BL21(DE3) using the pGEX-4T-1 expression vector system. The recombinant proEbCtL protein was overexpressed as a approximately 55 kDa fusion protein. The overproduced soluble GST-fusion protein was then applied to glutathione-Sepharose 4B column chromatography; the sample harboring the fusion protein evidenced a high degree of purity when analyzed via SDS-PAGE and Western blot analysis. Its activity was quantied by cleaving the synthetic peptide Z-FR-AMC, Z-LLE-AMC, and Suc-AAF-AMC, and the optimal pH for the protease activity was 8, 9.5, and 9, respectively.

• 한국식생활문화학회지
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• 제34권6호
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• pp.785-792
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• 2019

This study examined the changes in the protein and mineral composition of Gryllus bimaculatus fermented with Bacillus substilis and the mycelia of Basidiomycetes. Normal Gryllus bimaculatus (S) and experimental group data obtained after an inoculation of Bacillus substilis (SC) (KACC 19623), Pleurotus eryngii (SP) and Cordyceps millitaris (SC) were compared. The crude protein content of the Gryllus bimaculatus (control) was 75.48%, but it decreased to 64.55, 54.32, and 63.53% after fermentation with SB, SP and SC, respectively (p<0.05). An analysis of the organic elements showed that the contents of the carbon and nitrogen sources were also reduced after fermentation, and the most significant decrease was observed after fermentation with SP. In SDS-PAGE, a 120 kDa and a 48 kDa protein of Gryllus bimaculatus were found. On the other hand, protein bands faded after fermentation with SP and SC, respectively. Moreover, no visible band was observed after fermentation with SB. According to amino acid analysis, the total free amino acid content increased 3.84 and 1.74 times after fermentation with SB and SP, respectively, compared to the corresponding baseline data. In contrast, it decreased by 0.52 times after fermentation with SC. Among the essential amino acids found in crickets fermented with SB, the valine and isoleucine content was 3.57 and 2.64 times higher, respectively, than the recommended daily amount of essential amino acids.