This study was carried out to compare the semen characteristics, frozen-thawed sperm viability and testosterone concentration and in vitro fertilization (IVF) and development of in vitro matured pig oocytes between two Yorkshire boars. Semen and blood samples were collected once per week from October to November 2002 from two adult Yorkshire boars at 18 months of age with 170 kg body weight. Sperm were deep frozen in 5 ml maxi-straws with lactose-egg yolk and N-acetyl-D-glucosamine (LEN) diluent and stored in liquid nitrogen. Blood samples were obtained at 10 a.m. by inserting a 21 gauge, hypodermic needle attached to 10 ml syringe into surface veins in the ear. The concentration of testosterone was determined by Competitive Enzyme Immunoassay. Ovaries were collected from prepubertal gilts at a local slaughter house. Cumulus oocyte complexes were aspirated from antral follicles (3 to 6 mm in diameter). The medium used for oocyte maturation was modified TCM 199. After about 22 h of culture, oocytes were cultured without cysteamine and hormones for 22 h at $38.5^{\circ}C$, 5% $CO_2$ in air. For IVF, one frozen 5 ml straw was thawed at $52^{\circ}C$in 40 sec and was diluted with 20 ml Beltsville thawing solution at room temperature. Sperm were washed 2 times in mTLP-PVA and inseminated without preincubation after thawing. Oocytes were inseminated with $2{\times}10^7$/ml sperm concentration. Oocytes were coincubated for 6 h in 500 ${\mu}$l mTBM fertilization medium. At 6 h after IVF, oocytes were transferred into 500 ${\mu}$l NCSU-23 culture medium for further culture of 48 and 144 h. There were no significant differences in the semen volume, motility, normal acrosome morphology and sperm concentration of raw semen between A and B of Yorkshire boar. However, motility and normal acrosome of boar A were higher than those of boar B at 0.5, 2, 3, 4, 5 and 6 h incubations of frozen-thawed sperm. Testosterone concentration (3.75 ng/ml) of boar A was higher than that (2.34 ng/ml) of boar B. The rate of blastocyst formation (15.1%) of boar A was higher than that (10.4%) of boar B. In conclusion, serum testosterone concentration of boar showed very important role for the frozen-thawed sperm viability and the blastocyst formation of pig oocytes matured in vitro.
The aim of present experiment was to examine commercial synthetic extender(AndroMed) for semen cryopreservation of Korean Black Bull. Semen was collected from a Korean Black Bull using an artificial vagina and transported to the laboratory. The semen was diluted 1:1 by AndroMed. The pellect was diluted to final sperm concentration of $5{\times}10^5/ml$ by doubling in every 10 minutes at $4^{\circ}C$ cold chamber. The semen was equilibrated for 1 hr at cold chamber and packed to 0.5 ml straw. The semen straws were located above 5 cm of liquid nitrogen for 5 minutes, above 5 cm for 10 minutes and above 10 cm for 10 min. And then the frozen straw was plunged to $LN_2$. The presented straws were examined the viability and motility after thawed at $37^{\circ}C$ water bath. Hanwoo semen was used as KPN (Korea Proven Bull Number) in this experiment. The survival rates was significantly higher in fresh semen than frozen semen ($80{\pm}14%\;and\;43{\pm}11%$). However, the motility rates was similar (80.7% and 66.4%). The survival and motility rates were higher in 5cm, 10 min treatment group than the other two groups in straw-located height and duration above $LN_2$ ($50{\pm}14%$ and 70.7% vs, 33.18% and $65{\pm}7%$ vs, 30.14% and 65.7%, respectively). The development rates to cleavage was higher in Black Cow than Hanwoo semen (62.2%, 64.4%), However, The development rates to blastocyst was higher in Hanwoo than Black cow semen (25.9%, 23.0%). In conclusion. The present results that acceptable fertilization and cryopreservation could be obtained by in vitro fertilization with frozen-thawed semen using a synthetic semen extender (AndroMed).
본 연구는 0.5ml straw를 이용한 정자 동결융해 시 응해 온도가 동결정자의 성상에 미치는 영향을 파악하고 미니 돼지의 동결정액에 최적화된 적정 응해 조건을 찾기 위하여 실시하였다. 정액동결 straw를 37, 50 및 $70^{\circ}C$에서 각각 5초, 10초 및 45초간 융해하여 생존율(SYBR-14/PI staining), 정자원형질막기능검사 (Hypoosmotic Swelling Test) 및 첨체반응율(CTC : chlorotetracycline staining)을 검사 한 결과, $70^{\circ}C$에서 5초간 융해한 정자의 생존율과 CTC 결과가 $37^{\circ}C$와 $50^{\circ}C$에서 10초 및 45초간 융해한 처리구보다 유의적(p<0.05)으로 높은 생존율과 낮은 비율의 첨체 반응율을 얻었다. 따라서 미니돼지의 동결 정액은 고온에서 단시간 융해를 하는 것이 정자의 성상에 유리한 것으로 사료된다.
In previous studies, we reported that sow which was transferred OPS-freezing embryos not able to deliver a piglet (Kim et al, 2004). This study was conducted to investigate a possibility of gilt as recipients which produce piglets after transfer of OPS-freezing embryos. All transferred embryos were prepared by in vitro production (IVP) system. In vitro culture (IVC) medium used glucose-free NCSU23 supplemented with 5mM sodium pyruvate, 0.5 mM sodium lactate and 4 mg/ml bovine serum albumin for 2 days at $39^{\circ}C$. From day 3 of IVC, 10% fetal bovine serum albumin was added to the culture medium. In preparing of freezing embryos, embryos were treated with 7.5 $\mu g/ml$ cytochalasin-B for 30 min and centrifuged at $13,000{\times}g$ for 13 min. And then, embryos were exposed sequentially to an ethylene glycol (EG) solution, aspirated into open pulled straw (OPS), and plunged or thawed into the liquid nitrogen. In embryo transfer (ET), we used two kinds of type (surgical method vs. non-surgical method). In surgical method of embryo transfer, $55\sim65$ embryo were transferred in both uterine horn of two recipient gilts by plastic straw. Non-surgical method which is like artificial insemination was performed on three gilts. Each 140 frozen embryos were transferred to two gilts and 40 fresh embryos to one gilt. Pregnancy establishment was shown one recipient at 45 days after ET. However, the one recipient was also aborted at 58 days after ET. These results suggest that gilts can be considered as a candidate of recipients for OPS-freezing embryo transfer.
This study was conducted to investigate the survival rate of frozen-thawed spermatozoa in equine by glycerol concentration and freezing speed Two stallions (1 Thoroughbred-13 year old and 1 Arab-7 year old) bred in Korea Racing authority was examined for 1 times in a couple of weeks. Semen was collected by condom method standing heated mare and were centrifuged 650 g for 15 min. and isolated the seminal plasma. Thick fraction of semen was diluted EDTA-Lactose-egg yolk diluents to 1:1 and contained in 0.5 ml straw as $6{\sim}14{\times}10^7\;cells/ml$. Final concentrations of glycerol were 3, 5 and 7% in cryopreseved diluents and added 4 times for 2 hours equilibration. For the freezing, equilibrated straws were located 3 or 5 em above $LN_2$ gas for 5 or 10 min. Survival rates of pre-frozen sperm were $65.0{\pm}13.2%$, $68.3{\pm}10.4%$, $66.7{\pm}11.5%$ and post-frozen were $53.3{\pm}23.1%$, $45.0{\pm}15.0%$, $50.0{\pm}18.0%$ in 3, 5, 7% glycerol concentration, respectively. There was no difference between glycerol concentrations. Survival rates of frozen-thawed sperm on freezing speed were $36.7{\pm}10.4%$, $40.0{\pm}7.1%$, $30.0{\pm}13.2%$ at 3 cm-5 min and $33.3{\pm}11.5%$, $31.7{\pm}2.9%$, $21.7{\pm}10.4%$ at 3 cm-10 min in 3, 5, 7% glycerol concentration, respectively. Survival rates of frozen-thawed sperm on freezing speed were $43.3{\pm}15.3%$, $32.0{\pm}17.9%$, $22.3{\pm}15.7%$ at 5cm-5 min and were $47.5{\pm}15.0%$, $43.3{\pm}12.6%$, $48.3{\pm}15.3%$ at 5cm-10 min in 3, 5, 7% glycerol concentration, respectively. There were significantly different between groups (p<0.05). These results suggest that glycerol concentration did not affect cryopreservation of stallion semen within 3~7% but freezing speed affects. In our experiment, the best cryopreservation condition was at 5 cm above $LN_2$ gas for 10 min for pre-freezing and 7% of glycerol concentration. These results lead to commercial AI with frozen-thawed stallion semen.
Ha, A-Na;Fakruzzaman, Md.;Lee, Kyeong-Lim;Wang, Erdan;Lee, Jae-Ik;Min, Chan-Sik;Kong, Il-Keun
한국수정란이식학회지
/
제28권2호
/
pp.141-147
/
2013
The purpose of this study was attempted to new methods in mammalian embryos vitrification. This method was affected to increase of the embryo vitrification efficiency and it would be applied to the field of embryo transfer to recipient by modified loading method of embryo into 0.25 ml plastic straw. The frozen mouse embryos were carried out warmed from two different cell stages (8-cell and blastocyst, respectively) by attachment of an embryo in the vitrification straw (aV) method. All groups were cultured in M-16 medium to determine the development and survivability for 24 h, respectively. Results shown that, the survivability of two different groups were significantly different (94.8% vs. 70.9%). Total cell number was not significantly different the non-frozen blastocyst ($99.7{\pm}12.4$) compared to the post-thaw blastocyst ($94.8{\pm}15.1$). From the 8-cell embryo, total cell number of frozen blastocysts were significantly lower than others groups ($74.7{\pm}14.6$, p<0.05). In the case of cell death analysis, the blastocysts from non-frozen and frozen-thawed 8-cell group were not different ($0.0{\pm}0.0$ vs. $1.9{\pm}3.1$, p>0.05). However, the apoptotic nuclei of blastocyst were significantly observed the frozen-thawed group ($5.4{\pm}4.4$) compared to non-frozen group (p<0.05). Therefore, this new method of embryos using in-straw dilution and direct transfer into other species would be more simple procedure of embryo transfer rather than step-wise dilution method and cryopreservation vessels, so we can be applied in animal as well as human embryo cryopreservation in further.
The studies on the carried out to investigate the effective concentration of cryoprotectant agents and sucrose by one-step straw method of bovine embryos. The follicular oocytes were cultured in TCM-199 medium containing 10 IU/ml PMSG(Sigma, USA), 10 IU/ml hCG(Sigma, USA), 1$\mu\textrm{g}$/ml $\beta$-estradiol(Sigma, USA) and 10% FCS for 24~48 hrs in incubator with 5% CO2 in air at 38.5$^{\circ}C$ and then matured oocytes were again cultured for 12~18 hrs with motile capacitated sperm by preincubation of heparin. The bovine embryos following dehydration by cryoprotective agents and various concentrations of sucrose were directly plunged into liquid nitrogen and thawed in 3$0^{\circ}C$ water. Survival and in vitro developmental rate was defined as devellpmental rate on in vitro culture or FDA-test. The results are smmarized as followes : 1. The high in vitro developmental rates of bovine frozen embryos after rapidly thawed in freezing medium was attained 2.0M glycerol, 2.0M DMSO, 1M or 2.0M propanediol. 2. The high in vitro developmental rates of bovine frozen embryos after rapidly thawed in freezing medium was obtained single cryoprotectant(6.7~17.4%) than mixed cryoprotectants(6.7~16.7%). 3. In vitro developmental rate of bovine embryos after rapid frozen-thawing in the freezing medium added 0.25M and 0.50M sucrose were higher cleavage rate than those of sucrose concentration of 0.75M and 1.00M. 4. The freezing methods on in vitro developemental rates of bovine embryos was attained slow freezing method(9.70~15.6%) higher than rapid freezing method(9.4~13.3%).
본 연구는 미세조작된 수정란의 초급속 재동결 후 발생능을 조사하기 위해서 수행하였다. 먼저 4세포기 생쥐 수정란으로부터 할구세포 한 개를 떼어내고 이들 수정란을 동결액에 넣어 상온에서 2.5분간 평형시킨 다음, 0.25ml straws에 넣어 곧바로 액체질소에 침지시켰다. 4세포기 수정란의 동결액으로는 4.0M(ethylene glycol 및 0.25M sucrose가 함유된 dPBS를 사용하였따. 상실배기 수정란의 동결을 위해서는 항동해제로 4.0M ethylene glycol 대신에 5.0M glycerol을 사용하였다. 융해후 biopsied 4세포기 수정란을 M16 배양액에서 상실배기까지 발달시킨 다음 상실배기용 동결액을 이용하여 초급속 재동결을 실시하였다. 재동결융해 후 발달한 biopsied 배반포기 수정란을 대리모에 이식하여 이들 수정란의 생존성을 검토하였다. 제1차 동결후 biopsied 수정란의 체외발달률은 78%로서 정상적인 수정란의 발달율(91%) 보다 낮은 성적으로 보여주었으나 (P<0.01), 이들 수정란의 이식 후 임신률은 각각 25 및 30%로서 두 실험군간에 차이가 인정되지 않았다. 그리고 biopside 상실배기 수정란의 초급속 재동결후 체외 발달률 및 임신률은 각각 89와 27%로서 biopsied 되지 않은 수정란의 성적 (각각 95 및 28%)과 유사하였다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때, 본 연구에서 사용된 초급된 재동결 과정이 미세조작된 생쥐수정란의 생존성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
This study was carried out to establish most suitable freezing condition, to evaluate the different glycerol concentration of freezing and thawing rates on motility, viability, membrane integrity and acrosome intecrity of frozen Korean Jeju Black Bull spermatozoa, Semen was collected from a Korean Jeju Black Bull using an artificial vagina and transported to the laboratory. The semen was extended gradually 1:5 then cooled slowly for 2 hrs to 4$^{\circ}C$. The semen was diluted 1:1 with cryoprotectant extenders (3%, 5% and 7% glycerol) and equilibrated for 2 hrs at cold chamber and packed to 0.5 ml straws. The semen straws were located above 3 cm of liquid nitrogen for 5 minutes, above 5 cm for 10 min and above 8 cm for 10 min. And then the frozen straw was plunged into LN$_2$. The presented straws were examined the viability and motility after thawed at 37$^{\circ}C$ water bath. The viability and membrane integrity immediately post-thawing were significantly higher in samples frozen in 7% glycerol than 3% and 5% glycerol (p<0.05). After CTC staining to assess acrosome integrity, F pattern was significantly increased, but B pattern was significantly decreased in 7% glycerol (p<0.05). Freezing distance of 5 cm from liquid nitrogen and pre-cooling for 10 min yield better survival and membrane integrity, but not significant difference. However, AR pattern according to CTC staining was significantly decreased in 3 cm for 5 min.
본 연구는 미니 돼지와 일반 돼지(Duroc)의 동결융해 후 정자의 수정 능력을 비교하여 동결 보존체계의 기틀을 확립하고자 하였다. 정액 제조는 수압법으로 정액 채취하여 1차 희석하였다. 동결은 LEY (1차: 11% ${\alpha}$-lactose+egg yolk, 2차: 1차 동결액+glycerol+OEP) 동결액을 이용하여 동결을 실시하여 동결 보존하였다. 동결 정액의 융해는 0.5 ml straw를 각각 20, 37 및 $50^{\circ}C$ water bath에서 1분, 40 초 및 10초간 융해하여 세척 과정 후 BTS 5 ml를 첨가하여 $37^{\circ}C$에서 배양하였다. 정자 성상 검사로는 기형율(Rose Bengal staining), 첨체율(Chlortetra-cycline staining) 및 생존율(SYBR-14/PI staining)등을 배양 후 0, 3, 6, 9 및 12시간에서 검토하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 정자의 보존 시간에 따른 기형율은 동결 융해 직후 miniature pig가 $19.5{\pm}1.7%$ 로 Duroc의 $13.9{\pm}0.3%$에 비해 유의적으로 높았다. (p<0.05). 첨체 검사에서 수정능 획득이 일어나지 않은 F pattern은 동결 융해 후 miniature pig와 Duroc 종 정액이 $24.1{\pm}2.8%$와 $37.9{\pm}1.1%$로 Duroc 종에서 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났으며, 동결 융해후 miniature pig와 Duroc 종의 AR pattern은 $21.1{\pm}1.6%$ 및 $15.5{\pm}2.2%$로 miniature pig가 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났다. 융해 온도별 생존율에서는 20과 $37^{\circ}C$에서는 두 종간에서 유의적 차이는 없었으나, $50^{\circ}C$에서는 miniature pig가 $63.8{\pm}3.6%$로 $47.4{\pm}3.2%$인 Duroc 종에 비해 유의적(p<0.05)으로 높게 나타났다. 본 연구의 결과로부터 첨체율과 기형율에 대한 연구를 보완함으로써 miniature pig정액의 안정적인 동결 체계를 확립할 수 있을 것으로 판단된다.
본 웹사이트에 게시된 이메일 주소가 전자우편 수집 프로그램이나
그 밖의 기술적 장치를 이용하여 무단으로 수집되는 것을 거부하며,
이를 위반시 정보통신망법에 의해 형사 처벌됨을 유념하시기 바랍니다.
[게시일 2004년 10월 1일]
이용약관
제 1 장 총칙
제 1 조 (목적)
이 이용약관은 KoreaScience 홈페이지(이하 “당 사이트”)에서 제공하는 인터넷 서비스(이하 '서비스')의 가입조건 및 이용에 관한 제반 사항과 기타 필요한 사항을 구체적으로 규정함을 목적으로 합니다.
제 2 조 (용어의 정의)
① "이용자"라 함은 당 사이트에 접속하여 이 약관에 따라 당 사이트가 제공하는 서비스를 받는 회원 및 비회원을
말합니다.
② "회원"이라 함은 서비스를 이용하기 위하여 당 사이트에 개인정보를 제공하여 아이디(ID)와 비밀번호를 부여
받은 자를 말합니다.
③ "회원 아이디(ID)"라 함은 회원의 식별 및 서비스 이용을 위하여 자신이 선정한 문자 및 숫자의 조합을
말합니다.
④ "비밀번호(패스워드)"라 함은 회원이 자신의 비밀보호를 위하여 선정한 문자 및 숫자의 조합을 말합니다.
제 3 조 (이용약관의 효력 및 변경)
① 이 약관은 당 사이트에 게시하거나 기타의 방법으로 회원에게 공지함으로써 효력이 발생합니다.
② 당 사이트는 이 약관을 개정할 경우에 적용일자 및 개정사유를 명시하여 현행 약관과 함께 당 사이트의
초기화면에 그 적용일자 7일 이전부터 적용일자 전일까지 공지합니다. 다만, 회원에게 불리하게 약관내용을
변경하는 경우에는 최소한 30일 이상의 사전 유예기간을 두고 공지합니다. 이 경우 당 사이트는 개정 전
내용과 개정 후 내용을 명확하게 비교하여 이용자가 알기 쉽도록 표시합니다.
제 4 조(약관 외 준칙)
① 이 약관은 당 사이트가 제공하는 서비스에 관한 이용안내와 함께 적용됩니다.
② 이 약관에 명시되지 아니한 사항은 관계법령의 규정이 적용됩니다.
제 2 장 이용계약의 체결
제 5 조 (이용계약의 성립 등)
① 이용계약은 이용고객이 당 사이트가 정한 약관에 「동의합니다」를 선택하고, 당 사이트가 정한
온라인신청양식을 작성하여 서비스 이용을 신청한 후, 당 사이트가 이를 승낙함으로써 성립합니다.
② 제1항의 승낙은 당 사이트가 제공하는 과학기술정보검색, 맞춤정보, 서지정보 등 다른 서비스의 이용승낙을
포함합니다.
제 6 조 (회원가입)
서비스를 이용하고자 하는 고객은 당 사이트에서 정한 회원가입양식에 개인정보를 기재하여 가입을 하여야 합니다.
제 7 조 (개인정보의 보호 및 사용)
당 사이트는 관계법령이 정하는 바에 따라 회원 등록정보를 포함한 회원의 개인정보를 보호하기 위해 노력합니다. 회원 개인정보의 보호 및 사용에 대해서는 관련법령 및 당 사이트의 개인정보 보호정책이 적용됩니다.
제 8 조 (이용 신청의 승낙과 제한)
① 당 사이트는 제6조의 규정에 의한 이용신청고객에 대하여 서비스 이용을 승낙합니다.
② 당 사이트는 아래사항에 해당하는 경우에 대해서 승낙하지 아니 합니다.
- 이용계약 신청서의 내용을 허위로 기재한 경우
- 기타 규정한 제반사항을 위반하며 신청하는 경우
제 9 조 (회원 ID 부여 및 변경 등)
① 당 사이트는 이용고객에 대하여 약관에 정하는 바에 따라 자신이 선정한 회원 ID를 부여합니다.
② 회원 ID는 원칙적으로 변경이 불가하며 부득이한 사유로 인하여 변경 하고자 하는 경우에는 해당 ID를
해지하고 재가입해야 합니다.
③ 기타 회원 개인정보 관리 및 변경 등에 관한 사항은 서비스별 안내에 정하는 바에 의합니다.
제 3 장 계약 당사자의 의무
제 10 조 (KISTI의 의무)
① 당 사이트는 이용고객이 희망한 서비스 제공 개시일에 특별한 사정이 없는 한 서비스를 이용할 수 있도록
하여야 합니다.
② 당 사이트는 개인정보 보호를 위해 보안시스템을 구축하며 개인정보 보호정책을 공시하고 준수합니다.
③ 당 사이트는 회원으로부터 제기되는 의견이나 불만이 정당하다고 객관적으로 인정될 경우에는 적절한 절차를
거쳐 즉시 처리하여야 합니다. 다만, 즉시 처리가 곤란한 경우는 회원에게 그 사유와 처리일정을 통보하여야
합니다.
제 11 조 (회원의 의무)
① 이용자는 회원가입 신청 또는 회원정보 변경 시 실명으로 모든 사항을 사실에 근거하여 작성하여야 하며,
허위 또는 타인의 정보를 등록할 경우 일체의 권리를 주장할 수 없습니다.
② 당 사이트가 관계법령 및 개인정보 보호정책에 의거하여 그 책임을 지는 경우를 제외하고 회원에게 부여된
ID의 비밀번호 관리소홀, 부정사용에 의하여 발생하는 모든 결과에 대한 책임은 회원에게 있습니다.
③ 회원은 당 사이트 및 제 3자의 지적 재산권을 침해해서는 안 됩니다.
제 4 장 서비스의 이용
제 12 조 (서비스 이용 시간)
① 서비스 이용은 당 사이트의 업무상 또는 기술상 특별한 지장이 없는 한 연중무휴, 1일 24시간 운영을
원칙으로 합니다. 단, 당 사이트는 시스템 정기점검, 증설 및 교체를 위해 당 사이트가 정한 날이나 시간에
서비스를 일시 중단할 수 있으며, 예정되어 있는 작업으로 인한 서비스 일시중단은 당 사이트 홈페이지를
통해 사전에 공지합니다.
② 당 사이트는 서비스를 특정범위로 분할하여 각 범위별로 이용가능시간을 별도로 지정할 수 있습니다. 다만
이 경우 그 내용을 공지합니다.
제 13 조 (홈페이지 저작권)
① NDSL에서 제공하는 모든 저작물의 저작권은 원저작자에게 있으며, KISTI는 복제/배포/전송권을 확보하고
있습니다.
② NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 상업적 및 기타 영리목적으로 복제/배포/전송할 경우 사전에 KISTI의 허락을
받아야 합니다.
③ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 보도, 비평, 교육, 연구 등을 위하여 정당한 범위 안에서 공정한 관행에
합치되게 인용할 수 있습니다.
④ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 무단 복제, 전송, 배포 기타 저작권법에 위반되는 방법으로 이용할 경우
저작권법 제136조에 따라 5년 이하의 징역 또는 5천만 원 이하의 벌금에 처해질 수 있습니다.
제 14 조 (유료서비스)
① 당 사이트 및 협력기관이 정한 유료서비스(원문복사 등)는 별도로 정해진 바에 따르며, 변경사항은 시행 전에
당 사이트 홈페이지를 통하여 회원에게 공지합니다.
② 유료서비스를 이용하려는 회원은 정해진 요금체계에 따라 요금을 납부해야 합니다.
제 5 장 계약 해지 및 이용 제한
제 15 조 (계약 해지)
회원이 이용계약을 해지하고자 하는 때에는 [가입해지] 메뉴를 이용해 직접 해지해야 합니다.
제 16 조 (서비스 이용제한)
① 당 사이트는 회원이 서비스 이용내용에 있어서 본 약관 제 11조 내용을 위반하거나, 다음 각 호에 해당하는
경우 서비스 이용을 제한할 수 있습니다.
- 2년 이상 서비스를 이용한 적이 없는 경우
- 기타 정상적인 서비스 운영에 방해가 될 경우
② 상기 이용제한 규정에 따라 서비스를 이용하는 회원에게 서비스 이용에 대하여 별도 공지 없이 서비스 이용의
일시정지, 이용계약 해지 할 수 있습니다.
제 17 조 (전자우편주소 수집 금지)
회원은 전자우편주소 추출기 등을 이용하여 전자우편주소를 수집 또는 제3자에게 제공할 수 없습니다.
제 6 장 손해배상 및 기타사항
제 18 조 (손해배상)
당 사이트는 무료로 제공되는 서비스와 관련하여 회원에게 어떠한 손해가 발생하더라도 당 사이트가 고의 또는 과실로 인한 손해발생을 제외하고는 이에 대하여 책임을 부담하지 아니합니다.
제 19 조 (관할 법원)
서비스 이용으로 발생한 분쟁에 대해 소송이 제기되는 경우 민사 소송법상의 관할 법원에 제기합니다.
[부 칙]
1. (시행일) 이 약관은 2016년 9월 5일부터 적용되며, 종전 약관은 본 약관으로 대체되며, 개정된 약관의 적용일 이전 가입자도 개정된 약관의 적용을 받습니다.