Kim, Min-Young;Na, Sea-Jin;Suh, Chang-Woo;Kim, Chang-Ho;Lee, Na-Hyun;Lee, Eun-Kyu
한국생물공학회:학술대회논문집
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한국생물공학회 2003년도 생물공학의 동향(XIII)
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pp.555-559
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2003
EK를 고정화하기 위해 니켈 친화결합 방법과 공유 결합형 고정화 방법을 수행하였으며 니켈 친화결합이 공유 결합형 고정화보다 높은 고정화 수율과 activity를 나타냈다. 풀림과 재접힘을 이용한 효소의 활성 회복은 공유결합형 고정화가 니켈 친화결합보다 높은 결과를 나타내었다. 또한 기질의 분자량 크기에 따른 절단율의 차이가 없었으므로 레진 공극 내부로의 확산도 차이에 의한 절단반응의 차이는 없는 것으로 나타났고, 기질 종류에 따른 EK의 활성은 작은 기질이 큰 기질보다 높은 활성을 보였다.
아스파탐 전구체의 보다 효율적인 효소적 합성 방법을 개발하기 위하여 thermolysin의 고정화 방법을 확립하고자 고정화 담체로서 다공성 수지인 Amberlite XAD-7을, 가교화제로서 glutaraldehyde를 사용하여 최적 고정화 조건을 조사하고자 하였다. Thermolysin이 Amberlite XAD-7에 흡착되는 속도는 초기에 빠른 것으로 나타났으며, $5^{\circ}C$에서 24시간후는 96%가 흡착되었다. Thermolysin에 대한 Amberlite XAD-7의 최대흡착량은 수지 l당 340g 이상이었으며, 투입한 thermolysin 양이 300g일 때까지는 흡착된 양의 증가하는 관계는 직선관계를 보여주었다. thermolysin의 가교화를 위한 효과적인 pH와 glutaraldehyde의 농도, 가교화시간은 각각 $pH\;6.0{\sim}7.0,\;6{\sim}12.5%$ 및 $3{\sim}7$시간이었다. 특히 glutaraldehyde 6%에서는 7시간, 12.5%에서 3시간의 가교화가 효소의 잔존역가와 가교화 정도를 현저히 높였다. 이때의 잔존역가는 30% 이상인 것으로 나타났다.
과산화수소를 이용한 펜톤(Fenton)산화법은 수처리 및 토양 복원분야에서 활용되는 친환경 산화방법이다. 이 방법으로 오염물질을 제거할 때, 오염물의 농도에 따라 과산화수소의 농도를 적절하게 조절하는 것이 상당히 중요하다. 이에 본 연구에서는 HRP (horseradish peroxidase) 효소를 이용한 전기화학적 바이오센서를 제조하고 효소의 활성과 과산화수소의 검출 특성에 대한 연구를 수행하였다. SPCE (Screen Printed Carbon Electrode)의 작업 전극 표면에 키토산과 AuNP를 이용하여 HRP를 전착하였다. 이 후, 전위주사법(CV)과 전기화학적 임피던스 분광법(EIS)을 이용하여 효소의 고정화를 확인하였다. 또한 시간대전류법(CA)과 UV 분광법으로부터 HRP 효소의 활성을 확인하였다. 본 연구에서 제조한 바이오센서를 PBS 전해질에 담그고 과산화수소를 적정하여 CA 분석으로부터 전극에서 발생하는 전류를 측정하였다. 발생 전류는 과산화수소의 농도에 대하여 선형적으로 증가하였으며, 전류로부터 과산화수소의 농도를 예측할 수 있는 검정곡선을 도출하였다.
Seo, Hyo-Jin;Jung, Il-Hyong;Nam, Soo-Wan;Kim, Byung-Woo;Kim, Sung-Koo
생명과학회지
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제14권5호
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pp.794-799
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2004
Bacillus subtilis NAl/pKBl으로부터 생산된 cyclodextrin glucanotransferase (CGTase)는 cyclodextrin (CD)의 생산에 이용되었으며, 이에 사용된 CGTase는 ion-exchange chromatography와 gel filtration chromatography에 의해 정제되었다. 정제된 CGTase는 pH 6.0-7.0 범위, 60-$70^{\circ}C$에서 최대 활성을 나타내었으며, 다양한 이온결합성 고정화 담체를 이용하여 정제 효소의 고정화를 실시한 결과, 강염기성 음이온교환수지인 Amberlite IRA-900이 가장 우수한 고정화 효율을 나타내었다. 고정화된 효소는 pH 6.0, $60^{\circ}C$에서 최대 활성을 나타내었고, 그 활성이 약 1개월간 유지되어 cyclodextrin을 생산하기 위한 연속반응기내에서 장기간 사용이 가능함을 알 수 있었다.
Immobilon-AV 친화성 막에 glucose oxidase[EC1.1.3.4](725units/mL)를 고정하여 백금 전극에 부착시킨 전극을 사용하여 glucose를 전류법으로 정량하였다. 이때 glucose가 gluconic acid로 산화될 때 전류를 +0.8V vs. Ag/AgC1에서 측정하였다. 효소 고정화된 막을 부착시킨 전극의 감응 특성은 다음과 같다. 직선 감응범위는 0.2mM에서 20mM이었으며, 정량한계는 10-3 mM이었다. 또한 감응 시간은 12초, 효소 고정화된 막의 최적 pH(CH3COONa/CH3COOH)는 5.5, 그리고 수명은 27일 이였다. 그리고 다른 생리 활성물질의 방해는 없었다. 또한 고구마를 이용하여 AOAC 방법으로 정량한 glucose 측정값을 비교해 본 결과, 그 상대오차는 0.1%였다.
이 연구에서는 가수분해효소인 Orientase 22BF를 5가지 당체에 흡착법을 사용해서 고정시키고 충전층반응기에 넣어 흡수도를 비교함으로써 고정화효율을 평가하였다. 결과는 다음과 같다. 최적 담체는 Celite IT 640, Duolite A568, 그리고 Silicagel 60이었으며, 담체의 최적조건은 pH 5.0, 온도 $50^{\circ}C$로 나타났다. 또한 이 연구에서 peptide solution을 얻기 위하여 난황 단백질을 사용하였다.
A strain of Saccharomyces cerevisiae BY-366 was isolated to produce a strong sucrose-hydrolyzing enzyme. After entrapment of yeast cell invertase with alginate, enzymatic properties of immobilized cells were investigated. The results are as follows. 1. The optimum pH of invertase in immobilized cells and non- immobilized cells was 6.0 and 5.0, and pH stability of invertase in immobilized cells and non- immobilized cells was 6.0 and 5.0, respectively. 2 Activation energy of immobilized cells was 4.7 kcal/mol. 3 The immobilized preparation exhibited high resistance to heat and urea Induced denaturation. 4, The bead size less than 2 mm in diameter was desirable. 5. In spite of repeated use, the enzyme activity of immobilized cells was inhibited slightly in batch reaction, and a small column of the immobilized preparation could hydrolyze relatively high concentration of sucrose almost quantitatively to more than 6 days.
Chitosan을 담체로 이용하여 aminoacylase를 고정화하는 조건을 연구한 결과는 다음과 같다. 담체의 최적 activation조건은 pH 6.0, glutaraldehyde 0.2%, 반응시간 120분이었다. 그리고 activated chitosan에 aminoacylase를 고정화하는데 가장 적당한 효소농도는 80mg/20ml 이었고, 이때 coupling time은 90분이 가장 적절하였다.
용액 상에서 페놀류에 대해 95%의 분해특성을 지니는 동식물세포유래의 효소(horseradish peroxidase, HRP, EC 1.11.1.7)를 다공성 탄소 전극에 고정화시키고 이를 전기화학 반응기에 도입하여 전극반응에 의해 연속적으로 발생되는 과산화수소를 이용하여 페놀의 분해를 수행하였다. FT-IR 분석을 통해 다공성탄소전극 표면에 HRP의 아민기와 펩티드 결합을 위한 카르복실기가 생성되었음을 확인하였고 가교제(coupling agent)로 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC)를 이용하여 공유결합으로 고정화시켰다. 또한 HRP를 활성화 시켜 페놀을 처리하기 위해 전해질로 사용된 인산염 완충용액의 농도($10{\sim}200$ mM)와 pH($5.0{\sim}8.0$), 외부 산소 주입량($10{\sim}50$ mL/min)및 potentiostat/galvanosta에 의한 외부 공급전압($-0.2{\sim}-0.8$ volt, vs. Ag/AgCl)의 조건을 달리하며 RVC 전극 표면에서 발생되는 과산화수소 농도 및 전류효율을 고려하여 최적 자체 발생조건을 결정하였다. HRP가 고정화된 RVC 전극은 초기 고정화된 HRP 활성에 대해 4주 동안 89%의 상대적 효소 활성도(relatively enzymatic activity)를 지니는 안정한 전극임을 확인하였으며 실험실 스케일의 연속식 전기화학 반응기에 도입되어 최적 과산화수소의 발생조건에서 86%의 분해 효율을 보였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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