• 한국동물번식학회:학술대회논문집
• /
• 한국동물번식학회 2003년도 학술발표대회 발표논문초록집
• /
• pp.40-40
• /
• 2003

형질전환체 제작 시 발현벡터가 삽입되는 위치에 따라 발현 또는 억제되는 현상인 ‘position effect(위치효과)’를 극복하기 위해 Matrix Attachment Region(MAR)을 포함하는 발현벡터를 제작하였다 MAR는 핵 기질(nuclear matrix) 부착 부위로 발현조절에 관여하는 전사인자 등이 존재하는 핵 기질 부착부위로, 삽입된 발현벡터가 전사활성을 할 수 있는 게놈 환경을 제공해 주어 형질전환 유전자 발현을 향상시켜 준다고 보고되고 있다. 본 연구에서는 사람에서 이미 분리되어 염기서열이 밝혀진 MAR를 PCR로 증폭하였다. 증폭된 1,270 bp의 human alpha-1-antitrypsin MAR와 1,080 bp human corticosteroid binding globulin promoter MAR를 T vector에 클로닝하여 염기서열을 확인했으며 발현벡터 클로닝에 사용하였다. 유용 유전자와 세포 형질전환에 사용할 선별 유전자로 neo를 포함하며, 그 외 벡터골격은 pGL3 control vector를 사용하여 기본 발현벡터를 제작하였다. 이 벡터에 MAR를 5', 3' 양쪽 또는 한쪽만 포함하도록 클로닝하였다. 이는 MAR의 위치에 따른 게놈내 삽입 및 발현효과를 확인하여 형질전환동물 생산용 발현벡터로 활용하고자 한다.

• 미생물학회지
• /
• 제36권2호
• /
• pp.109-111
• /
• 2000

Lactobacillus casei ssp. casei NCIB 4114 균주로부터 3,5kb의 플라스미드를 분리하여, 이 플라스미드를 함유하는 Escherichia coli-Lactobacillus 셔틀 백터(shuttle vector)들을 만들었다. tu틀 벡터들은 모두 electroporation에 의해 성공적으로 형질전환 되었다. Electroporation의 최적조건은 벡터DNA 1$\mu$g당 $2{\times}10^5$ 형질전환체의 효율이었고, 이들 벡터의 성공적 도입은 이들 벡터의 유산균에서의 음식등급 벡터로의 사용 가능성을 제시하였다.

• 미생물학회지
• /
• 제43권2호
• /
• pp.147-149
• /
• 2007

국내에서 분리한 백색부후균 기계충버섯(Irpex lacteus)과 아교버섯(Phlebia tremellosa)을 대상으로 유전자 도입을 위한 형질전환 방법을 확립하였다. 아교버섯의 정우 원형질체 생성 및 재생 방법을 이용하여 이핵체(dikaryon)로부터 일핵체(monokaryon: Pt05-2)를 얻어 실험에 사용하였다. 형질전환체의 선발을 위한 선택표지는 glutamine synthetase의 inhibitor인 phosphinothricin에 대하여 저항성을 부여하는 유전자(bar)를 사용하였고, 이 유전자를 가진 형질전환용 벡터, pBARGEM7-1 ($5\;{\mu}g$)과 제한효소 EcoRI (30 u)를 동시에 원형질체에 처리하는 제한효소매개 삽입방법을 사용하였다. 기계충버섯($5{\times}10^{7}\;cells$)및 아교버섯($2.5{\times}10^{7}\;cells$)의 원형질체를 대상으로 형질전환을 수행한 결과 벡터 $1\;{\mu}g$당 각각 형질전환체 50-70개 및 15-25개의 수율을 보였으며 형질전환용 벡터가 각 형질전환체에 안정되게 존재함을 확인하였다.

• 미생물학회지
• /
• 제50권4호
• /
• pp.372-375
• /
• 2014

본 연구에서는 백색부후균인 겨울우산버섯의 원형질체 분리 조건과 유전자 형질전환 방법을 확립하였다. 겨울우산버섯 균사에 세포벽 분해효소로 0.5% Usukizyme을 처리하여 ml당 $1{\times}10^7/ml$개의 원형질체를 확보할 수 있었다. 형질전환체의 선별을 위해 hygromycin에 대한 저항성을 갖는 유전자(hph)를 선택표지로 이용하여 형질전환용 벡터(pHYgpt)를 제작하였다. 40% polyethylene glycol 용액과 aurintricarboxylic acid와 heparin, supermidine을 첨가하여 형질전환을 수행 한 결과 벡터 $1{\mu}g$ 당 100-160개의 수율로 형질전환체를 얻었다. 도입된 벡터는 hph 유전자의 PCR 증폭을 통해 형질전환체의 염색체내에 삽입되었음을 확인하였다. 이러한 결과는 polyporus 속의 유전자를 활용한 새로운 균주 개발에 유용한 기술이 될 것이다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
• /
• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
• /
• pp.14-14
• /
• 2001

본 연구는 생명공학 관련 기술개발에 의하여 신소재 물질을 생산하고 사람에게 안전하고 생리활성이 높은 고가의 의료용 단백질 생산기술을 체계화하며 형질전환 가축을 이용한 유용물질 생산에 따른 산업화와 부가가치의 극대화에 그 목적이 있다. 유즙으로 사람의 빈혈치료제인 EPO(Erythropoietin)를 분비할 수 있는 형질전환돼지를 생산하기 위하여 WAP(Whey Acidic Protein) Promoter(2.6kb) 하류에 사람의 조혈촉진유전자(EPO: 2.6kb)를 연결시켜 미세주입용 재조합 벡터(WAP-EPO : 약 7.8kb)를 구축하였다. 구축된 재조합 벡터를 1세포기 수정란에 약 2ng/ul 농도로 미세주입한 다음 외과적 방법으로 이식하였다. 이식 후 분만 모돈으로부터 생산된 자돈의 꼬리조직을 이용 게놈DNA를 추출하고 PCR 검정을 한 결과, 유즙으로 사람의 빈혈치료제를 생산할 수 있는 유전자가 도입된 형질전환돼지 $\boxDr$새롬이$\boxUl$ (♂)를 확인하였다. 또한 이렇게 꼬리조직으로부터 확인된 새롬이의 혈액과 정액을 채취, 게놈 DNA를 추출하여 외래 유전자 삽입여부를 PCR 방법으로 검정한 결과 꼬리조직과 마찬가지로 혈액 및 정액에서도 외래유전자가 삽입되었음을 확인할 수 있었다. 이렇게 생산된 형질전환돼지 $\boxDr$새롬이$\boxUl$를 이용 계대번식을 통한 F$_1$ 산자의 생산과 유전자 전이율을 확인하기 위하여 $\boxDr$새롬이$\boxUl$정액을 이용한 인공수정을 실시하였다. 인공수정은 1999년 7월 1일부터 2000년 9월 8일 까지 총 78두의 모돈을 이용하였으며, 그 중 21두의 모돈이 분만하여 인공수정에 의한 분만율은 26.92%로 나타났다.(Table Omitted) Table 1에서와 같이 새롬이 정액을 이용한 인공수정에 의해 형질전환된 F$_1$ 자돈의 형질전환율은 17.98%로 나타났으며, 32두의 형질전환자돈 중 8두(암:4두, 수:4두)는 분만과 동시에 폐사하였거나 사육중 폐사하여 현재 24두(암:12두, 수:12두)가 생존하여 F$_1$ 간 교배계획에 의해 사육되고 있다. 이 중 암컷 4두는 현재 F$_2$ 자돈 생산과 함께 유즙내로 사람 빈혈치료제의 분비 유무를 검정중에 있으며, FISH 법에 의한 외래 유전자 삽입 검정을 확인 중에 있다.

• 식물조직배양학회지
• /
• 제25권3호
• /
• pp.147-152
• /
• 1998

AL1-gene은 TGMV의 복제에 매우 중요한 역할을 하고 있다. 이 AL1 gene의 발현을 억제하기 위해서는 식물체내에서 AL1 gene의 antisense RNA의 발현에 의한 억제가 효과적 방법 중에 하나로 알려져 있다. 이런 발현을 식물체내에서 실현시키기 위해 hygromycin 저항성 유전자에 antisense AL1-gene을 연결시키고, 연결된 부위를 CaMV35s-promoter와 octopine synthase gene terminator 사이에 연결시켰다. 이 유전자 발현 단위 부분을 다시 kanamycin 저항성 유전자 발현 단위 부분을 지니고 있는 형질 전환 벡터인 pBinAR에 삽입시켜 새로운 형질 전환 벡터인 pAR35-2를 개발하였다. 이 벡터를 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 형질전환 시킨 다음, 토마토와 담배 잎사귀 조직에 감염시켜 식물체들을 kanamycin과 hygromycin이 함유된 배지위에서 배양하여 형질전환된 식물체들을 선발하였다. 형질 전환된 식물체들로부터 antisense AL1-gene 및 antisense RNA를 각각 PCR 및 RT-PCR를 이용한 southern hybridization 방법을 이용하여 증명하였고, 토마토 식물체의 공변세포쌍 내에 있는 엽록체 숫자가 여덟 개라는 것이 확인되어 형질 전환된 토마토 식물체가 2 배수체로서 정상적인 식물체라는 것을 증명하였다. 이러한 형질 전환 식물체는 앞으로 항 바이러스성 형질을 지니는 식물체들을 개발하는 데 많은 도움을 주리라 여겨 진다. 그리고, 본 연구에서 제조된 벡터 pAR35-2는 두 개의 항생제에서 동시 선발 할 수 있도록 되어 있고 promoter가 두 개로 되어 있어 형질 전환 식물체선발 및 유전자 발현 연구에 효과적으로 이용되어 질 수 있으리 라 여겨진다.

• 한국식물병리학회지
• /
• 제11권2호
• /
• pp.173-178
• /
• 1995

동물계에서 항바이러스와관련된 dsRNA 의존성 인산화 효소(PKR)의 유전자를 식물체에서 발현시킬 경우 PKR에 의한 단백질합성 및 식물바이러스의 증식조절 가능성에 대한 기초자료를 확보하기 위하여 사람에서 분리된 PKR cDNA를 Agrobacterium 방법에 의하여 연초식물체(Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc)로 형질전환시켰다. HindIII/PstI처리에 의해 얻어지는 약 1.8kb의 phPKR cDNA절편을 일련의 유전자 조작 방법을 통하여 식물발현벡터인 pBI121에 도입하여, p12168을 재조합하였다. 이를 A. tumefaciens LBA 4404에 형질전환시켜 연초식물체형질 전환에 이용하였다. 2mg/l BA와 0.5mg/l NAA가 포함되고 100$\mu\textrm{g}$/ml의 kanamycin이 첨가된 MS배지에서 shooting시킨 후 phytohormone이 첨가되지 않은 MS배지상에서 rooting을 시켜 형질전환 연초식물체를 얻었으며, 형질전환식물체는 정상식물체와 유사한 생육양상을 나타내었다. 형질전환식물체의 유전자도입은 hPKR cDNA의 전사부여는 RT-PCR 방법에 의하여 확인되었다.

• 식물조직배양학회지
• /
• 제24권5호
• /
• pp.305-311
• /
• 1997

Bacillus thuringiensis는 그람 양성 토양 세균으로 포자형성시 결정화된 내포체를 형성하는데, 이 내포체를 구성하는 결정단백질은 각 곤충에 대하여 특이적인 독성을 나타낸다. 살충성 결정단백질 중 Cry II A 결정단백질은 인시류와 쌍시류 곤충에 모두 특이적으로 작용한다. 결정단백질은 살충제로서 불안정하고 포장에서 지속성이 낮은 단점을 가지고 있으므로, 본 연구에서는 Cry II A 결정단백질 유전자가 형질전환된 담배 식물을 제작하고자 하였다. cry IIA 유전자가 삽입된 벡터를 대장균에 형질전환한 후, 알칼리 용액에 대한 용해도의 차이를 이용하여 Cry II A 결정단백질(70 kDa)을 분리하였고, 분리한 Cry II A 결정단백질을 trypsin 처리하여 활성화된 Cry II A (50 kDa)를 확인하였다. 식물 형질전환을 위하여 두 개의 CaMV 35S promoters에 의해 발현이 조절되는 식물 발현 벡터에 cry II A 유전자를 클로닝 하였다. 이 식물 발현 벡터를 Agrobacterium을 이용한 엽편형질 전환을 통해 담배(N. tabacum var. Petit Havana SRI)에 형질전환 시켰으며, 재분화 과정을 거쳐 여섯 개체의 형질전환 식물체를 얻었다. Southern blot을 통하여 분석한 결과 세 개체 내에 cry II A 유전자가 존재하였는데, 한 개체에는 하나의 cry II A 유전자가, 또 한 개체에는 두 개의 cry II A 유전자가, 다른 한 개체에는 잘려진 형태의 cry II A 유전자가 존재함을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 얻어진 cry II A 형질전환 식물체는 살충성 검정 등을 거친 후 내충성 식물 생산 및 후대 유전 양상 분석을 위한 기초 자료로 이용될 수 있을 것이다.

• 원예과학기술지
• /
• 제29권6호
• /
• pp.623-632
• /
• 2011

본 연구는 배추에서 항암물질 PEITC의 함량을 높이기 위하여 PEITC 대사과정에서 관련 유전자인 myrosinase (MYR)와 Glutathione S-transferase(GST) 유전자를 분리하고 Agrobacterium tumefacien 형질전환 방법을 통하여 유전자 발현을 조절하였다. 분리된 MYR과 GST의 cDNA는 각각 1647bp와 624bp임을 확인하였고 pET system으로 단백질의 발현을 확인하였다. 형질전환을 위해서 MYR-과발현 벡터와 GST-발현억제 벡터를 제작하였으며 이를 이용하여 배추에 형질전환한 후 PCR 검정을 통해 MYR-과발현 벡터로 형질전환된 개체(IMS) 13개체를 GST-발현억제 벡터로 형질전환된 개체(IGA) 5개체를 선발하였다. 선발된 $T_0$ 개체는 $T_1$ 세대로 진전시켰으며 $T_1$ 형질전환 계통의 서던분석 결과 배추 genome내로 1-4 copy의 T-DNA가 삽입된 것을 확인하였다. 유전자 발현양을 real-time RT PCR로 조사한 결과 IMS는 발현량이 1.03-4.25배 증가하였고 IGA는 26.42-42.22배 감소하였다. IMS와 IGA의 각 계통에서 PEITC의 농도를 GC-MS 방법을 이용하여 확인한 결과 IMS는 PEITC 함량이 형질전환이 되지 않은 대조군에 비해 최대 4.86배까지 증가한 계통을 확인하였고 IGA는 최대 3.89배까지 증가된 계통을 확인하였다. 최종적으로 본 연구를 통하여 항암물질 PEITC량의 증가를 보인 형질전환계통 IMS 1, 3, 5, 12, 15 및 IGA 1, 2, 4를 선발하였다.

• 생명과학회지
• /
• 제18권3호
• /
• pp.304-310
• /
• 2008

고온 단백질 heat shcok protein 70 (HSP70)은 분자샤페론으로써 환경스트레스와 발달단계 동안 단백질을 보호하고 합성하는 다양한 과정에 관여하는 기본적인 단백질이다. 하지만 그 생물학적 기능이 식물에서 아직 정확하게 밝혀지지 않았다. 이에 본 연구에서는 담배에서 고온에 의해 유도된 HSP70인 NtHSP70-1 (AY372069)를 분리하여 그 기능을 연구하였다. NtHSP70-1의 고온 내성 기능을 분석하기 위해 NtHSP70-1이 식물 형질전환용 벡터인 pBKS1-1에 sense 또는 antisense 방향으로 도입되어 형질전환된 식물체와 pBKS1-1만 도입된 형질전환 식물체들을 제조하였다. 형질전환체에 있어서 NtHSP70-1의 발현량은 western blot 분석법을 사용하여 수행하였고 확인된 형질전환체들은 고온 내성 기능분석에 이용되었다. 그 결과 고온 환경에 있어서 NtHSP70-1이 과다발현된 형질전환체들은 그 클로로필의 함량과 생존율이 정상환경 일 때와 유사하였고 반대로 벡터 또는 벡터인 pBKS1-1에 antisense 방향으로 도입되어 형질전환된 식물체들은 클로로필의 파괴로 인한 감소된 생존율을 나타내었다. 고온 처리된 형질전환 식물체에서 클로로필의 함량비교 결과로 NtHSP70-1이 클로로필을 보호함으로써 식물의 고온내성에 기여함을 알 수 있었다.