• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2001.03a
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• pp.14-14
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• 2001

본 연구는 생명공학 관련 기술개발에 의하여 신소재 물질을 생산하고 사람에게 안전하고 생리활성이 높은 고가의 의료용 단백질 생산기술을 체계화하며 형질전환 가축을 이용한 유용물질 생산에 따른 산업화와 부가가치의 극대화에 그 목적이 있다. 유즙으로 사람의 빈혈치료제인 EPO(Erythropoietin)를 분비할 수 있는 형질전환돼지를 생산하기 위하여 WAP(Whey Acidic Protein) Promoter(2.6kb) 하류에 사람의 조혈촉진유전자(EPO: 2.6kb)를 연결시켜 미세주입용 재조합 벡터(WAP-EPO : 약 7.8kb)를 구축하였다. 구축된 재조합 벡터를 1세포기 수정란에 약 2ng/ul 농도로 미세주입한 다음 외과적 방법으로 이식하였다. 이식 후 분만 모돈으로부터 생산된 자돈의 꼬리조직을 이용 게놈DNA를 추출하고 PCR 검정을 한 결과, 유즙으로 사람의 빈혈치료제를 생산할 수 있는 유전자가 도입된 형질전환돼지 $\boxDr$새롬이$\boxUl$ (♂)를 확인하였다. 또한 이렇게 꼬리조직으로부터 확인된 새롬이의 혈액과 정액을 채취, 게놈 DNA를 추출하여 외래 유전자 삽입여부를 PCR 방법으로 검정한 결과 꼬리조직과 마찬가지로 혈액 및 정액에서도 외래유전자가 삽입되었음을 확인할 수 있었다. 이렇게 생산된 형질전환돼지 $\boxDr$새롬이$\boxUl$를 이용 계대번식을 통한 F$_1$ 산자의 생산과 유전자 전이율을 확인하기 위하여 $\boxDr$새롬이$\boxUl$정액을 이용한 인공수정을 실시하였다. 인공수정은 1999년 7월 1일부터 2000년 9월 8일 까지 총 78두의 모돈을 이용하였으며, 그 중 21두의 모돈이 분만하여 인공수정에 의한 분만율은 26.92%로 나타났다.(Table Omitted) Table 1에서와 같이 새롬이 정액을 이용한 인공수정에 의해 형질전환된 F$_1$ 자돈의 형질전환율은 17.98%로 나타났으며, 32두의 형질전환자돈 중 8두(암:4두, 수:4두)는 분만과 동시에 폐사하였거나 사육중 폐사하여 현재 24두(암:12두, 수:12두)가 생존하여 F$_1$ 간 교배계획에 의해 사육되고 있다. 이 중 암컷 4두는 현재 F$_2$ 자돈 생산과 함께 유즙내로 사람 빈혈치료제의 분비 유무를 검정중에 있으며, FISH 법에 의한 외래 유전자 삽입 검정을 확인 중에 있다.

• Korean Journal of Plant Tissue Culture
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• v.28 no.4
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• pp.221-225
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• 2001

Some factors of wounding methods, solidifying agents, origin of leaf explants, cone. of acetosyring-one, and MES affecting regeneration and transformation by Agrobacterium tumefaciens were investigated to establish an efficient transformation system of apple. Wounding by cutting the leaves merely showed the tendency of regeneration and transformation with higher efficiency compared with that of wounding by non-traumatic forcep when carrying out co-cultivation for three days after bacterial inoculation. While examining the solidifying agents of medium with the combination of agar (A)＋Gelrit $e^{ }$ (G) in g. $L^{-1}$ , the higher concentration of Gelrit $e^{ }$ increased the efficiency of regeneration. However, there was no difference in the efficiency of transformation from the treatments of 2.5 G, 3.5 A+1.2 G, and 7.0 G. The origin of leaf explants showed no difference statistically in the efficiency of regeneration and transformation, but that from the shoots of proliferation medium showed the tendency with higher efficiency. The concentration of above 0.1 mM acetosyringon had an increase in the efficiency of regeneration and transformation and the concentration of 0.15 mM had the highest efficiency of transformation in the treatment of acetosyringone with different concentration. There was no effect of MES on regeneration and transformation.ion.

• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2002.06a
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• pp.61-61
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• 2002

비 반추동물 특히 돼지의 경우 섬유소 소화율이 극히 낮은 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구는 섬유소분해효소유전자 (CelD) 를 췌장특이 프로모터인 rat Elastase Ⅰ 하류에 연결하여 구축된 벡터를 수정란내 미세주입한 후 생산된 형질전환 돼지를 이용하여 섬유소 소화능력을 측정하기 위하여 실시하였다. 먼저 35두의 수란돈으로 부터 65 두의 산자를 생산하였으며, PCR 분석 결과 4두가 형질전환돼지로 판명되었으며 이중 3두가 죽고, 생존한 l두를 다시 southern blot 분석결과 형질 전환된 것으로 판단하여 같은 복의 6두와 함께 섬유소 소화율을 측정하기 위하여 분리사육을 실시하였다. (중략)

• Korean Journal of Microbiology
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• v.34 no.3
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• pp.120-125
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• 1998

A plasmid pNPG contains a genomic DNA complementing npgA1 which is located on the left arm of linkage group I. It transformed Aspergillus nidulans at a high frequency. No abortive transformants were observed and the $Trp^+$ transformants were all $Npg^+$. The 10.4 kb Psti fragment of the genomic DNA was subcloned into pILJ16, which increased the transformation efficiency by more than 200-folds. The transformants were mitotically unstable and yielded $Arg^-$ conidia at the frequency of more than 80%. An additional gene cloned into the plasmid containing the fragment was always lost with $argB^+$ marker. These characteristics strongly indicate the possibility that the plasmids autonomously replicate. The full activity of enhanced transformation was retained on the 4.9 kb EcoRI-HaeIII fragment. The DNA segment was similar to AMA1 rather than ANS1 in function and designated AMA2.

• Journal of Plant Biotechnology
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• v.35 no.1
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• pp.69-74
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• 2008

This study aims to establish the efficient soybean transformation system and develop soybean [Glycine max (L.) Merill] transformants using cotyledonary node explants. The cotyledonary node of soybean were co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens strains (KYRT1, EHA105). These strains contain the binary vector pCAMBIA3301 which carries a herbicide-resistant far gene. Korean cultivars (Danbaekkong, Eunhakong) and foreign cultivars (Jack, Peking) were the most efficient in regenerating cotyledonary node. Therefore, they were chosen for the transformation. Results showed that the T-DNA transfer reached up to 60% and transformation efficiency reached up to 3% in the cotyledonary node explants from Jack cultivar, co-cultivated with EHA105 strain. Histochemical GUS evaluation showed that 12 individual lines, transformed with the 현 gene, have positive response. The transformed soybeans have been confirmed in the $T_0$ generation through phenotypic assay using herbicide $Basta^{(R)}$ and Southern blot analysis.

• Proceedings of the KSAR Conference
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• 2001.03a
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• pp.17-17
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• 2001

착상전 수정란 단계에서 형질전환 수정란의 선발은 형질전환동물의 효율을 증대시킬 수 있는 방법이다. 성공적인 형질전환동물의 생산을 위해서는 생산된 수정란의 mosaicism 빈도를 감소시켜 전체 할구에서의 유전자 발현을 유도하는 것이 최적일 것이다. 따라서 본 연구에서는 돼지의 웅성 생식세포를 이용한 형질전환동물의 생산에 있어서 다양한 정자세포 이용시 형질전환 수정란의 생산성 및 mosaicism 빈도를 조사하였다. 아울러 돼지 웅성생식세포내 GFP 유전자도입시 세포들의 생존율 및 원형정자세포분리 후 배양에 따른 형태적 변화를 관찰하였다. 돼지의 웅성 생식세포내 GFP 유전자 도입은 전기자극법 (1.3 ㎸/cm, 200 $\mu\textrm{s}$) 에 의하여 수행되었으며, 이 때 생존율은 60-70%이였다. 유전자가 도입된 전체 세포중 원형정자세포군의 분리는 유식세포분리기에 의하여 수행하였으며, 전체집단에 대한 분리군의 비율은 평균 16.2%이였다. 형질전환 수정란의 생산은 정자 (ICSI), 원형정자세포 (ROSI), 배양후 확장된 원형정자세포(ELSI)를 이용하였으며 각각의 난할율은 ICSI (82.9%), ROSI (59.1%), ELSI (62.1%)로 유의한 차이를 나타내었다. 그리고 8세포기까지의 배발달율은 각각 61.1, 40.9 및 48.6%이였으며, 상실배 및 포배기형성율은 각각 24.6, 18.1 및 32.4%이였다. 형광현미경하에서 GFP 단백질이 발현된 8세포기 수정란을 대상으로 각각의 할구를 primer extension pream-plification (PEP) PCR 방법으로 분석한 결과, ICSI 및 ROSI 실시후 대부분 (15/20, 9/10) 의 수정란은 3~4개의 할구에서만 GFP 유전자의 존재여부를 확인할 수 있었으며, 전체 할구에서 GFP 유전자가 모두 확인된 수정란은 없었다. 반면에 배양된 확장 원형정자세포를 이용하여 생산한 수정란의 경우, 4/10 (40%)에서 전체 할구내에 GFP 유전자의 존재를 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 비록 배발달율 및 GFP 유전자 발현율에 있어서는 ELSI방법이 ICSI 등의 방법보다 현저히 낮았지만, mosaicsism 빈도가 낮아 바람직한 형질전환 수정란 생산에서는 오히려 유용한 방법이라고 사료된다. 또한 외래 유전자의 도입효율 면에서 후기 원형정자나 성숙정자보다 초기 원형정자세포에 외래유전자를 도입한 다음, 성숙시킨 확장원형 정자세포를 이용하는 방법이 보다 우수하다는 것을 시사하였다. 따라서 본 연구결과는 포유동물의 웅성 생식세포를 이용하여 nonmosaicisn을 나타내는 형질전환수정란을 생산하고 선발할 수 있는 일련의 기술적 과정을 정립하였다고 사료된다.

• 한국유가공학회:학술대회논문집
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• 1997.05a
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• pp.41-61
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• 1997

젖산균의 유전자 연구를 촉진하기 위해 간단하고 신속한 plasmid DNA의 분리방법과 electro-poration을 이용하여 vector plasmid의 간단하고 신속한 전이방법을 얻기 위해 젖산균의 형질전환에 영향하는 요인에 대하여 연구하였으며 연구결과는 다음과 같다. 1. O'Sullivan과 Klaenhammer의 방법을 개선하여 젖산균 plasmid DNA의 분리에 좋은 결과를 얻을 수 있는 신속하고 쉬운 방법을 고안하였으며, genomic DNA 분리에 이용되는 guanidium thio-cyanate 처리방법을 plasmid의 분리에 적용할 수 있었다. 2. L. casei, L. acidophilus. L. delbruekii var. bulgaricus. L. brevis와 L. plantarum 균주에서 plasmid를 확인하였으며, 돼지 분에서 분리된 L. lactis ssp. lactis. L. fermentum과 L. plantarum에서도 plasmid를 분리 확인하였다. 3. Lactococci의 plasmid분리는 lactobacilli와는 달리 mutanolysin의 처리없이도 잘 되었으며, L. lactis ssp. lactis와 Ent. faecalis에서 plasmid를 확인하였다. 4. E. coli plasimd 분리에 이용되는 MPS membrane filter 방법으로 젖산균 plasmid pLZ12의 분리가 가능하였으나, 세포파편이 filter를 막아 사용에 어려움이 있는 것으로 확인되었다. 5. Plasmid 분리없이 electroporation을 이용한 세포 대 세포 전이법으로 간편하고 빠르게 E. coli DH5${\alpha}$에 E. coli Jm109의 plasmid pBX19, pBR322를 전이시켰다. 6. L. lactis ssp. lactis 균주에 lysozyme 처리시 30${\sim}$80%의 생존율을 보였으며, 대부분의 L. acidophilus 균주의 경우 약 70%의 생존율을 보였다. L. casei 102S의 경우는 45분간 처리 시에도 100%의 생존율을 보였다. 8. L. lactis ssp. lactis 균주에 pLZ12를 6.0kV에서 전이시킨 결과 12.5kV에서보다 형질전환 효율이 훨씬 높았으며 lysozyme 처리에 의해 형질전환 효율이 증가되었다. 9. L. acidophilus 균주에 pLZ12를 전이시 6.0kV에서는 전이가 모두 이루어졌으나, 12.5kV에서는 L. acidophilus WIESBY와 NCFM에서 전이가 이루어지지 않았으며, lysozyme 처리 후 pLZ12를 전이시켰을 때 12kV보다 6.0kV에서 형질전환 효율이 증가되었다. 10. Gene Pulser와 Progenitor II를 사용하여 pLZ12를 L. lactis ssp. lactis 균주에 전이하였을 때 Gene Pulser에 비해 Progenitor II의 형질전환 효율이 현저히 떨어졌다. L. acidophilus HY7008과 HY7001은 두 기기 모두 형질전환이 이루어졌으나, L. acidophilus WEISBY와 NCFM은 Progeni-tor II에서 전이가 일어나지 않았으며, Gene Pulser에서 전이균주를 얻어 두 electroporator간에 형질전환 효율의 차이를 보였다. 11. L. casei 102S에 pLZ12를 electroporation시 낮은 전압에서 형질전환 효율이 비교적 좋았으며, 배양 시기를 달리하여 전이시켰을 때 대수생장 말기의 세포가 형질전환 효율이 좋았다. 12. L. casei 102S세포를 각각 10% glycerol, EB, 2차 증류수 등에 녹여 electroporation을 실시하였을 때 각각 $3.8{\times}10^3$, $5.0{\times}10^2$,1.5${\times}10^2$cfu의 형질전환 효율을 보였으며, 1.0mM HEPES, TE buffer를 사용하였을 때에는 전이가 이루어지지 않았다. 13. Plasmid pLZ12의 농도를 달리하여 electroporation을 하였을 때 형질전환 효율이 농도에 비례하여 증가하였다. 14. L. casei 102S에 대수생장 말기의 세포를 채취하여 10% glycerol, 200 Ohms, 25 ${\mu}$FD, 10kV/cm로 plasmid pLZ12를 electroporation할 때 최대 형질전환 효율인 3.8${\times}$10$^{3}$cfu를 얻었으며, lysozyme 처리가 다른 젖산균과는 달리 형질전환 효율을 증가시키지 못하였다. 15. L. casei 102S 세포를 10% glycerol과 EB에 녹여 -20$^{\circ}C$에서 냉동시킨 다음 1일과 7일 후의 세포를 electroporation한 결과 냉동시 세포에 손상을 주는 것으로 인식되었다.

• Horticultural Science & Technology
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• v.18 no.6
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• pp.797-801
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• 2000

The present study was conducted to improve the efficiency of transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens in hot pepper. Both regeneration ratio and transformation frequency after the cocultivation with A. tumefaciens were affected by inoculation time and artificial wounding. Transformation frequency was increased over 50% by combining artificial wounding with 120 s of inoculation treatment. Confirmation for the transformation of regenerated shoots was carried out by histochemical ${\beta}$-glucuronidase assay and polymerase chain reaction analysis using npt II primer.

• Korean Journal of Plant Tissue Culture
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• v.24 no.5
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• pp.313-317
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• 1997

Leaf segments of the potato (Solanum tuberosum L.) genotypes, ND860-2, Norchip, Russet Norkotah, Goldrush, and Norqueen Russet were transformed with the coat protein gene of potato virus Y (PVY). The white-skinned genotypes, ND860-2 and Norchip, were easily transformed and regenerated into shoots, whereas the three russet-skinned genotypes had low frequencies of regeneration. Transformed shoots were generally recovered in four to six weeks. Antibody to PVY coat protein detected a single band of 30 kD in western blots of transgenic plants. Transformed plants had a normal phenotype in the greenhouse and many showed a delayed buildup of PVY following inoculation. Several transgenic lines had negative ELISA readings 85 days after inoculation. Transgenic lines which did not show detectable levels of PVY antigen will be further tested for resistance to PVY.

• Food Science and Preservation
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• v.7 no.4
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• pp.414-417
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• 2000

Competent cell transformation of B. subtilis AC819 was carried out using phenotypic protease-defective(Npr-) DNA of B. subtilis MT-2. An obtained transformant, designated B. subtilis HL-1, was obtained by homologous DNA recombination. Phenotypes of B. subtilis HL-1 were characterized histidine requirement streptomycin-resistance, tetracyclin resistance and non-producing protease. Protoplast transformation frequency of B. subtilis HL-1 by plasmid pUB110 was higher than that of B. subtilis MT-2. From this result, B. subtilis HL-1 is useful for protease gene transformation and thermostable protease gene cloning as a host.