• 생명과학회지
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• 제11권6호
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• pp.561-567
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• 2001

능이버섯[Sarcodon aspratus(Berk.)S.Ito]의 fibrin 분해 활성물질을 분리정제하기 위하여(N $H_4$)$_2$S $O_4$침전법, DE52 anion exchange column chromatography, Sephacryl-S2000 gel filtration chromatography 및 Mono S cation FPLC를 행하였으며 정제된 효소의 특성을 측정하였다. 혈전용해 요소의 활성물질은 DE52 anion exchange colum chroma-tography에 NaCI의 농도가 0.2M 정도에서 용출되었으며 계속된 Sephacryl-S200 gel fitration chromatography 및 Mono S cation EPLC를 실시한 결과 단일 Peak를 얻었고 혈전용해효소의 특이활성은 55.2 U/mg protein으로 조효소액으로 비하여 11.3 배 증가하였으며 수율은 49.5%이었다. 또한 Mono S cation EPLC에서 얻은 활성획분을 12% SDS-PAGE로 전기영동한 결과 단일 band를 얻었으며 gel filtration의 결과와 비교함으로서 정제된 능이의 혈전용해 효소의 분자량은 29.300 Da인 것으로 확인되었다. 능이로 부터 정제한 혈전용해효소는 pH가 높아질수록 효소활성이 증가하였으며 pH 10.5의 알카리성에서도 안정하였으며 6$0^{\circ}C$이상의 온도에서는 효소활성이 급격히 실활하기 시작하였지만 8$0^{\circ}C$에서 25%의 상대활성을 보였다. 또한 본 효소는 C $u^{2+}$이온 $Co^{3+}$ 이온 등 중금속에 의하여 68%및 38%활성이 저해되었으며 $Ca^{2+}$이온 또는 $Mg^{2+}$의 초딤색 인 EDTA및 serine protease inhibitor이 PMSF에 의하여 활성이 저해되었었다. 이러한 결과들은 능이의 혈전용해효소가 Ca.sup 2+/또는M $g^{2+}$에 의하여 활성이 증가하는 serine protease임을 암시해 주고 있다.

• 한국식품과학회지
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• 제44권5호
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• pp.600-606
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• 2012

콩을 소재로한 전통 발효식품으로부터 혈전용해능이 뛰어난 균주를 분리하였으며, B. subtilis로 동정되었다. 따라서 이를 B. subtilis IDCC 9204(특허균주기탁: KCTC-11471 BP), 그 혈전용해 효소는 NK-IL9204로 명명하였다. B. subtilis IDCC 9204가 생산하는 고역가의 NK-IL9204를 단백질 분석법에 기초하여 분석한 결과, 분자량은 27.7 kDa의 homogenous enzyme으로 확인되었다. 또한 기존에 알려진 일본의 발효식품인 낫도 유래의 B. subtilis var. natto가 생산하는 nattokinase 와의 sequence 분석을 진행한 결과, 99.5% homology가 일치하는 serine protease계열의 nattokinase로 확인되었다. 그러나 NK-IL9204는 물리 화학적인 조건에서 B. subtilis var. natto가 생산하는 nattokinase와 다소 차이를 나타내었으며 본 실험에서는 B. subtilis var. natto가 생산하는 nattokinase보다 상대적으로 높은 열 안정성과 pH 안정성을 나타내었다. In vitro 실험에서 NK-IL9204는 최적 반응온도 $40^{\circ}C$, 열 안정성은 $90^{\circ}C$까지 효소활성을 유지하였으며, 최적 반응 pH는 pH 8로 알칼리-혈전용해효소의 특성을 나타내었으며, 약산성에서 강알칼리 영역까지 넓은 pH 구간 안정성을 갖는 것이 특징이다. NKIL9204의 in vivo에서의 효능과 생체 내 안정성을 동물실험을 통해 확인한 결과, 생체 내에서도 혈전용해효소의 활성이 소실되지 않고 유지되며, 혈전분해와 관련된 생체 내 인자들을 활성화시키는 역할을 하는 특징을 갖는다. NK-IL9204는 30,000 FU/g 이상의 고역가를 달성하여 산업적 측면에서 생산성도 확보함으로써 수입의존적 원료를 국산화할 수 있을 것으로 예상된다.

• Applied Biological Chemistry
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• 제46권3호
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• pp.176-182
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• 2003

한국재래간장으로부터 혈전용해효소를 강하게 생산하는 균주를 선발하고 이를 Bacillus subtilis K7로 동정하였다. B. subtilis K7이 생산하는 혈전용해성 protease를 정제하여 분자량을 확인한 결과 21,500 Da이었다. 정제된 효소의 최적반응조건은 $40^{\circ}C$와 pH 9.0이었으며 pH 5.0라서 12.0까지 안정하고 $50^{\circ}C$에서 20분간 열처리한 후에도 50%이상의 효소활성을 가지며 EDTA, CDTA 및 iodoacetat에 실활하는 효소이었다. 이 효소의 fibrin에 대한 Km 값은 $1.8{\times}10^{-2}$ M이었다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제30권5호
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• pp.839-843
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• 2001

감마선 조사를 이용한 장류제품의 미생물 살균 시, 감마선 조사가 장류제품의 효소활성에 미치는 영향을 살펴보기 위한여 된장, 고추장, 간장, 청국장, 메주에 5, 10, 20 kGy의 선량으로 감마선을 조사한 다음 amylase, protease, lipase 그리고 혈전용해효소 활성을 비교하였다. 가수분해효소의 활성은 메주, 청국장, 된장에서 대체로 높았고 간장과 고추장은 상대적으로 낮았다. Amylase, protease, lipase의 효소활성은 10 kGy까지의 감마선 조사에 의하여 영향을 받지 않았으며, 20 kGy의 감마선 조사구에서는 10% 내외의 효소활성 감소가 있었으나 청국장의 protease 활성감소(15%)를 제외하고는 통계적인 유의차가 없었다(p<0.05). 혈전용해효소 활성은 20 kGy까지의 감마선 조사에 의해서 효소활성 변화가 없었다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제34권6호
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• pp.904-909
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• 2005

일본 청국장에서 분리된 Bacillus firmus NA-1를 이용하여 비지의 수분함량, 생대두미세분말첨가 및 발효시간에 따른 비지 발효물의 혈전용해효소, 점질물, 펩타이드생산 및 풍미 개선 효과를 알아보았다. 비살균 D-비지는 30시간 이상부터 청국장 발효가 진행되는 반면, 살균 D-비지는 18시간부터 고초균 발효에 의하여 pH가 증가하였으며 혈전분해효소, 펩타이드 함량이 비살균 D-비지보다 높은 값을 보였다 P-비지의 경우는 18시간 발효시에 가장 높은 pH, tyrisone 함량과 혈전용해효소활성을 나타냈다. 또한 P-비지를 건조하여 초기수분함량을 $60\%$로 낮추었을 때 발효비지물의 펩타이드 함량과 혈전용해분해효소활성이 증가하였다. p-비지에 전지활성 생대두미세분말을 $10\%$수준으로 첨가함으로써 혈전분해효소 및 펩타이드 함량이 증가되는 효과를 보였으며, 점질물의 생성에 따른 점조도 값의 증가를 나타내었다. 특히, 콩미세분말을 $20\%$ 수준으로 첨가하여 발효시킨 비지는 고유한 청국장의 풍미를 나타내었으며, 건조시킨 발효비지물의 조단백질함량은 $27.3\%$를 나타내었다. 따라서 비지의 고초균 발효시에 전지활성 생대두미세분말의 첨가는 비지의 초기수분함량을 낮추면서, 고초균 발효의 촉진을 통한 콩 펩타이드 및 혈전용해효소의 증가, 점질물 생산, 풍미 개선을 비롯하여 발효비지의 단백질 보강이 가능하였다.

• 한국영양학회:학술대회논문집
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• 한국영양학회 2001년도 춘계연합학술대회 초록
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• pp.217.1-217
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• 2001

• 한국식품과학회지
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• 제34권2호
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• pp.283-289
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• 2002

속성 발효 및 기능성 멸치액젓의 제조에 사용할 수 있는 미생물 starter의 개발을 목적으로 1, 3 그리고 5년 숙성한 멸치액젓으로부터 단백질 분해활성 및 혈전 용해 활성 우수한 균주를 분리, 동정하였고, 분리균주들 중 단백질 분해활성과 혈전 용해 활성 가장 강하였던 B. subtilis JM-3의 최적 성장 조건과 단백질 분해효소 및 혈전 용해효소 최적 생산조건들을 조사하였으며, 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1, 3 그리고 5년 숙성한 멸치액젓으로부터 단백질 분해활성과 혈전 용해 활성 가지는 3균주를 분리하였으며, 분리균주 JM-1, JM-2 그리고 JM-3는 모두 Bacillus subtilis로 동정되었다. 분리균주들 중 가장 강력한 단백질 분해활성과 혈전 용해 활성 나타낸 B. subtilis JM-3의 최적 성장조건은 $40^{\circ}C$, pH 5.0 그리고 NaCl를 첨가하지 않았을 때 성장이 가장 좋은 것으로 나타났다. B. subtilis JM-3의 단백질 분해효소 및 혈전 용해효소 최적 생산 조건은 최적 성장 조건과 일치하는 것으로 나타났다. 또한 멸치액젓의 일반적인 염농도인 NaCl 20% 첨가구에서도 식염 무첨가구의 약 60%의 활성을 나타내어 B. subtilis JM-3의 멸치액젓의 starter로서의 충분한 이용 가능성을 나타내었다.

• 한국균학회지
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• 제28권1호
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• pp.60-65
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• 2000

할미송이버섯으로부터 3단계를 거처 분자량이 각각 18 kDa(FE-1)과 18.2 kDa(FE-2)인 두 개의 혈전용해효소를 분리 정제하였다. 이 효소들은 지금까지 알려진 혈전용해 효소의 질량에 비해 비교적 작았고 두 효소(FE-1과 FE-2)의 15번째까지의 N-terminal amino acid서열은 A-L-Y-V-G-X-S-P-X-Q-Q-S-L-L-V로 같았다. FE-1은 ICP-MS의 결과 $Zn^{2+}$을 mole당 0.98 mole 포함하고 있는 metalloprotease로 pH 7.5와 $55^{\circ}C$에서 가장 큰 활성을 나타내고, 1,10-phenanthroline의 첨가 시 저하된 활성은 $Zn^{2+}$나 $Co^{2+}$의 첨가에 의해 재생되었다.

• 한국균학회지
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• 제36권2호
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• pp.183-188
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• 2008

3단계를 거처 식용 가능한 다발구멍장이버섯으로부터 분리한 혈전용해효소의 비활성은 30.49 U/mg이었으며, MALDI-TOF/MS로부터 분자량이 30086.41 Da이었다. 일차 아미노산 구조는 Glu-Thr-Val-Thr-Glu-Thr-Thr-Ala-Pro-Trp-Gly-Leu-Ser-Arg-Ile으로 밝혀졌으며, pH 8.0에서 pH 10.0의 넓은 범위에서 큰 활성을 나타내는 alkaline protease로, 최적온도는 $50^{\circ}C$이며, $30^{\circ}C$까지는 대체로 열에 안정한 효소였다. 이 효소는 합성 기질 N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe pNA을 강하게 분해하였으며, $Hg^{2+}$ 금속이온의 첨가로 효소 활성이 완전히 사라졌다. 효소저해제인 PMSF의 첨가로 혈전용해활성이 사라지는 결과로부터 serine 분해효소임을 알 수 있었다.

• 한국식품과학회지
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• 제31권2호
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• pp.553-557
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• 1999

혈전용해능을 가진 균류 (버섯류) 5종 Daedaleopsis styracina, Trichaptum abietium, Coriolus versicolor, Pisolithus tinctorius 그리고 Tricholomopsis decora 등을 선발하여 혈전용해효소 활성을 측정하였고, 기질 특이성을 조사하였다. 버섯 추출액을 조제하여 혈전 용해도를 측정한 결과 plasmin 1.0 unit 보다 $3{\sim}4$배의 높은 활성을 보였으며, 그 중 Pisolithus tinctorius이 가장 높은 활성(4.71 plasmin unit)을 나타내었고, Tricholomopsis decora가 Plasmin에 대한 기질 N-p-Tosyl-Gly-Pro-Lys p-nitroanilide에 대해 가장 높은 특이성(1.32 plasmin unit)을 보였다. 버섯의 균사체로부터 추출한 효소를 SDS-fibrin zymography 활성확인법에 의해 분석한 결과 분자량이 54와 61 kDa의 공통된 활성을 가지는 단백질을 확인하였으며, Trichaptum abietium는 100 kDa의 그리고 Tricholomopsis decora는 84 kDa의 강한 활성을 가지는 혈전용해효소를 확인하였다.