• 한국약용작물학회지
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• 제14권4호
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• pp.195-201
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• 2006

미생물 및 동물에 비해 식물에서는 혈전용해효소에 대한 연구가 매우 부족한 실정이며, 기존의 혈전용해효소가 가지는 혈전에 대한 비특이적, 부작용, 고가 등의 단점을 해결할 수 있는 새로운 혈전용해효소의 개발을 위하여 동백의 종자, 종피, 유엽 그리고 성엽으로부터 추출된 수용성 단백질의 혈전용해활성을 조사하였다. 각각의 동백부위로부터 추출된 조효소 용액은 기존 혈전 용해효소인 plasmin과 양성 대조군으로 하여 비교하여 fibrin agarose plate로 확인한 결과 fibrin clot을 효과적으로 분해하였다. 그 중 단백질 분해효소의 활성이 다른 부위보다 20-33배로 높았던 동백종자와 종피의 수용성 추출물의 혈전용해활성은 양성 대조군인 plasmin과 비교하여 1.6-2.0배의 높은 활성을 나타내었다. 전체 수용성 단백질은 30-80%황산암모늄을 이용하여 농축하였으며 혈전용해효소는 fibrin zymography를 수행하여 확인하였다. SDS-PAGE에 의하여 동백유엽의 혈전용해효소 분자량을 측정한 결과 45 kDa으로 단일 polypeptide임을 확인하였으며, 각종 pretense 저해제에 의한 영향을 조사한 결과 PMSF,그리고 TLCK에 강력하게 저해되는 것으로 보아 동백유엽의 혈전용해효소는 trypsin과 유사한 serine protease의 하나로 생각되었다. 그러나 EDTA와 DTT처리에 의해서는 효소활성의 저해가 두드러지게 나타나지 않고 오히려 증진된 양상을 확인할 수 있었다. 또한, 효소 활성에 미치는 pH 및 온도의 효과는 약간의 산성쪽에 가까운 pH 5.5와 $30^{\circ}C$에서는 최적의 활성을 나타내었으며, $45^{\circ}C$ 이상의 온도에서는 효소활성이 급격히 감소하였다. 이상의 모든 결과로 볼 때 동백유엽의 혈전용해효소는 trypsin과 유사한 serine protease에 속하는 혈전용해효소임을 확인할 수 있었다.

• KSBB Journal
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• 제21권1호
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• pp.20-27
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• 2006

미생물 및 동물에 비해 식물에서는 혈전용해효소에 대한 연구가 부족한 실정이며, 기존의 혈전용해효소가 가지는 혈전에 대한 비특이적, 부작용, 고가 등의 단점을 해결할 수 있는 새로운 혈전용해효소의 개발을 위하여 율무, 홍화, 아욱의 종자로부터 추출된 수용성 단백질의 혈전용해 활성을 조사하였다. 각각의 식물들로부터 추출된 조효소 용액은 기존 혈전 용해효소인 plasmin과 양성 대조군으로 하여 비교하여 fibrin 평판법으로 확인한 결과 피브린 응집을 효과적으로 분해하였다. 그 중 율무종자의 수용성 추출물의 혈전용해 활성은 양성 대조군인 plasmin과 비교하여 1.3배의 높은 활성을 나타내었다. 전체 수용성 단백질은 50-75% 에탄올을 이용하여 농축하였으며 율무의 혈전용해효소는 fibrin zymography를 수행하여 확인하고 직접 추출하였다. SDS-PAGE에 의하여 추출효소의 분자량을 측정한 결과 7.8 kDa으로 단일 polypeptide임을 확인하였으며, 효소 활성에 미치는 온도의 효과는 $50^{\circ}C$ 이상에서는 비교적 안정하였으나 더 낮은 온도에서는 급격히 효소활성이 감소하였다. 또한, 각종 단백질분해효소 저해제에 의한 영향을 조사한 결과 APMSF, PMSF, pepstatin A 그리고 TPCK에 강력하게 저해되는 것으로 보아 추출효소는 chymotrypsin과 유사한 serine protease의 하나로 생각되었다. 그러나 EGTA와 EDTA 처리에 의해서는 효소활성의 저해가 두드러지게 나타나지 않았다. 더욱이, 종자저장 중에 미생물에 의한 부패, 활력저하, 생리활성물질의 감소와 장기저장에 따른 에너지소비 증가 등이 문제가 되고 있어 저선량의 감마선 조사를 통해 율무, 홍화, 아욱의 종자로부터 혈전용해 효소활성에 미치는 효과 및 선량에 따른 차이를 조사하였는데 비조사 종자인 대조구와 비교하여 1 Gy, 4 Gy, 16 Gy, 32 Gy선량에서는 낮은 활성을 보였으면 반면에 8 Gy와 64 Gy의 선량에서는 더 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 Y선 조사가 종자의 혈전용해 활성을 향상시킬 가능성이 있을 것으로 생각된다. 이상의 모든 결과로 볼 때 율무의 추출 효소는 chymotrypsin-like serine protease에 속하는 혈전용해효소임을 확인할 수 있었다.

• KSBB Journal
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• 제21권6호
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• pp.433-438
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• 2006

Bacillus subtilis BB-1 (KFCC l1344P)으로부터 분리된 혈전용해효소 유전자 (BCF-1)를 대량발현 벡터인 pEB 벡터에 크로닝하여 순수분리 된 혈전용해효소를 rat 경구 투여하여 출혈시간, 혈액의 응고, serum의 혈전용해능 등에 대한 in vivo 실험을 실시하였으며, 혈전용해효소의 단회경구투여에 따른 독성을 검사하였다. 효소의 경구투여에 따른 rat의 출혈시간에서는 대조군에 비하여 모든 경구 투여군에서 출혈시간이 유의적으로 약 1.75배 이상 길게 나타남을 확인하였고(P<0.05), 혈액의 출혈시간 또한 활발히 진행됨을 관찰하였다. 혈액으로부터 분리된 serum의 혈전용해작용 있어서는 경구투여 후 1시간부터 채혈한 혈액 내에서 혈전용해효소의 활성이 검출되기 시작하여 3시간째까지 높은 활성을 보였으며 4시간째부터 서서히 활성이 감소하는 것을 확인하였고 혈액의 응고 역시 대조군에 비하여 경구 투여군에서 상당히 지연되는 것을 알 수 있었다. Western blot에 의한 효소 검출에서는 경구 투여군에서 30,000 Da 크기의 단일밴드를 확인하였으며, 혈전용해효소의 rat에 대한 단회경구투여 독성실험에서 중량의 변화, 장기의 이상여부, 사망률 등에서 어떠한 이상이나 병변이 발견되지 않았다. 이상의 결과로 동물실험을 통한 혈전용해 효소의 경구투여에 의한 작용을 혈액 내에서 확인 할 수 있었으며, 본 효소의 단회 경구투여 시의 독성은 전혀 없음을 확인할 수 있었다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제33권1호
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• pp.41-46
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• 2004

전통된장과 공장산 된장 제품, 메주와 Koji, 그리고 된장발효공정에서의 혈전용해효소 활성과 microflora의 상관관계를 조사하였다. 전통된장의 혈전용해 활성은 평균 2.42 unit/g으로 공장산 된장의 평균 1.58 unit/g보다 1 unit 이상 높은 분포를 나타내었으며 전통된장에서는 Bacillus의 밀도가 높았고 acid producing bacteria, 곰팡이, 효모는 모두 공장산 된장에서 높은 밀도를 나타내었다. 된장의 Bacillus group 분포와 혈전용해효소활성은 양의 상관관계를 나타내었으며 fungal group 분포와 혈전용해효소활성은 음의 상관관계를 나타내었다. 메주의 혈전용해 활성은 평균 6.54 unit/g수준으로 Koji의 1.46 unit/g보다 5 unit 이상 높은 분포를 나타내었으며 Bacillus의 서식밀도와 높은 상관관계를 보였다. 된장 발효과정 중 Bacillus와 곰팡이는 휴지 상태를 유지하였으며 혈전용해효소 활성도 담금 초기의 수준을 유지하였다. 결과적으로 된장의 혈전용해활성은 된장 담금 이전의 원료구성에 따라 결정되며, 메주나 Koji에서 유래된 혈전용해 효소는 된장의 발효과정에서도 계속 활성을 유지하는 것으로 확인되었다. 본 실험 결과, 혈전용해효소 활성이 높은 된장을 제조하기 위해서는 메주나 Koji의 제조공정에서 효소활성을 유도하여 된장 담금 시 첨가하는 공정의 설정이 유효할 것으로 제안하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제33권1호
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• pp.24-28
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• 2005

전통 된장으로부터 단백질 분해능이 있으면서 혈전용해활성이 우수한 D-1 균주를 분리하였다. 분리된 D-1 균주는 표준물질인 plasmin 2.51 $\mu}g$과 같은 혈전용해효소활성을 보였으며 이 균주를 동정하기 위하여 세포막 지방산 조성 분석과 탄수화물 이용성을 조사한 결과 김 등[12], 허 등[7] 청국장에서 혈전용해효소활성을 보이는 균주로 보고된 Bacillus subtilis로 유사하게 나타났다. 탄수화물 이용성, 세포막 지방산 분석 그리고 16S rRNA sequence를 통하여 Bacillus속으로 동정 할 수 있었고, 이에 된장으로부터 분리한 혈전용해효소를 생산하는 D-1균주를 최종적으로 Bacillus sp. D-1으로 명명하였으며 앞으로 이 균주를 이용하여 혈전용해효소를 함유하는 기능성 된장과 청국장 제조에 큰 효과를 보일 것으로 기대된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제31권3호
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• pp.271-276
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• 2003

한국의 전통 대두발효식품인 청국장에서 혈전용해능이 우수한 미생물을 분리하였으며, 이를 동정한 결과 B.amyloliquefaciens D4로 명명하였다. 혈전용해효소의 대량분비를 위해 N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine을 사용한 돌연변이를 유도하여 B. amyloliquefaciens D4-7 변이주를 얻었으며, plasmin 1 U/ml 6.5배 정도의 높은 혈전분해능을 나타내었다. B. amyloliquefaciens D4-7는 분리대두단백배지에서 혈전용해효소 분비능이 가장 우수하였다. B. amyloliquelaciens D4-7가 생산하는 혈전용해효소의 최적 활성조건은 pH 10, 5$0^{\circ}C$이었고, pH 7.0 에서 pH 11 사이에서 상대적으로 안정하였으며, $50^{\circ}C$에서 30분간 방치하였을 경우 50%의 활성이 유지되었다. 또한, NaCl, glycerol 또는glucose 첨가에 의해 혈전용해효소의 저장안정성이 높아지는 것을 확인할 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제23권2호
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• pp.259-266
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• 2013

혈전용해효소를 생산하는 균주 분리를 위해서 우선 한국, 일본 등지에서 모은 21개의 청국장 시료를 준비하였고 총 268개의 균주를 분리하였다. 이 중에서 1% skim milk가 포함된 nutrient agar 배지에서 protease를 생산하는 bacteria를 분리하였고, 이 결과로 22개의 균주가 분리되었다. 균주들은 apiweb을 통해 생화학적 특성에 근거하여 동정하였다. 또한 세균동정을 위해 16S rRNA 염기서열 분석을 수행하였다. 분리된 대부분의 균주는 Bacillus subtilis와 Bacillus amyloliquefaciens였다. 혈전용해효소의 활성은 fibrin plate 방법에 의해 측정되었고 A2-14, A2-20, C1-05, C1-09, F2-01로 명명된 다섯 균주가 선택되었다. 이중에서 A2-20 균주는 강한 혈전용해 활성을 보였고 동정결과 Bacillus amyloliquefaciens에 가까웠다. A2-20 균주에 의해 생산되는 혈전용해효소는 균 상등액을 이용한 gel filtration과 ion exchange chromatography를 거쳐 부분정제 되었다. 부분 정제된 효소의 최적 pH는 7.0이었고, 최적 온도는 $35^{\circ}C$였다. 정제된 단백질의 분석은 SDS-PAGE와 zymography로 이루어졌다. 이와 더불어 혈전용해효소의 유전자적 분석도 수행되었으며 A2-20 균주가 생산하는 혈전용해효소의 부분적인 염기서열과 유전적 상동성을 보이는 서열을 규명하였다.

• 생명과학회지
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• 제15권4호
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• pp.513-521
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• 2005

흑두로 제조한 청국으로부터 혈전용해력이 우수한 균을 선발하여 동정하였으며, 그를 Bacillus subtilis BB-1로 명명하였다. 이 균은 혈전용해효소 isozyme을 적어도 5개이상 생성하는 균주로 확인되었다. 이 균으로부터 크로모좀을 분리하여 shot gun법으로 혈전용해효소 유전자를 크로닝하였으며, 이 유전자를 BSF-1이라 명명하였다. 이 유전자는 714개의 아미노산을 암호화하고 있으며 기존에 밝혀진 혈전용해효소 유전자와 상동성은 검출되지 않은 새로운 혈전용해효소 유전자였다. 혈전용해효소활성 최적 pH 및 온도는 5.0과 $35^{\circ}C$였다. 기질특이성은 적혈구 배지 또는 skim milk, gelatin등에 전혀 분해활성이 없었다. 이는 혈전만을 특이적으로 분해하는 기질특이성을 보였으며, 혈전분해효소로서의 이용가능성이 충분한 것으로 판단된다.

• 생명과학회지
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• 제12권1호
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• pp.43-48
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• 2002

토양으로 부터 혈전용해효소를 생산하는 방선균을 분리하여, 본 방선균이 생산하는 혈전용해효소의 최적 생산 조건을 검토하였다. 생산균주는 회색의 기균사를 생성하며 약 0.6~0.8$\times$0.4~0.8$\mu\textrm{m}$ 크기의 원통형 포자를 가지며 포자의 표면은 매끈하며, 약 10~40개의 포자가 고리를 이루고 있는 형태를 나타내었다. 이상의 결과로 본 균주는 Sfreptomyces 속으로 추정되어 Streptomyces sp. JK-20로 명명하였다. 본 균주의 생리학적 특성으로 20~32$^{\circ}C$의 온도에서 생육 가능하며 최적 생육 온도 및 pH는 24$^{\circ}C$ 및 pH 6이었다. 본 균주의 혈전용해효소의 생산을 위한 최적 생산 조건을 검토한 결과 탄소원으로 1% xylose였고 질소원은 0.5% yeast extract, 0.5% polypeptone, 금속염은 0.1% MgSO$_4$.7$H_2O$였으며 인산염은 0.1% NaH$_2$Po$_4$.2$H_2O$이었다. 본 생산 균주를 최적 배지 조건에서 배양하였을 때 배양 4일째에 혈전용해효소의 생산력이 가장 높았다.

• 한국산학기술학회논문지
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• 제7권3호
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• pp.476-482
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• 2006

본 연구의 목적은 상업적으로 사용하기 위하여 혈전용해효소를 생성하는 세균인 MK-15를 분리하고 동정하는 것이다. 먼저 세균 MK-15는 자연 발효된 콩으로부터 농화분리하였으며, 이 세균에 대한 형태학적 및 다양한 생리학적 특성 조사를 실시하였다. MK-15의 배양 상등액으로부터 혈전용해효소 활성을 fibrin plate 방법으로 solid fibrinolytic activity를 측정하였다. 그 결과, 콩배지에서 자란 MK-15의 혈전용해활성은 대조군으로 사용된 plasmin의 혈전용해활성에 비하여 약 2.5배 높았다. 16S rRNA를 분석한 결과 균주 MK-15는 Bacillus subtilis 군과 99.9% 유사성을 나타내었다. 따라서, 이 세균은 Bacillus sp. MK-15로 명명하였으며. 균주 MK-15는 GenBank에 [DQ163021]로 등록하였다.