본 연구에서는 국내에서 식용으로 재배되고 있는 팽이버섯의 균사체에 대하여 Agrobacterium을 이용한 형질전환을 시도하였다. 특히 물리적 연마제인 미세 aluminum oxide 입자를 팽이 균사체와 함께 강하게 교반함으로써 물리적 상해를 지니는 균사체를 제조하였으며 감압침윤에 의한 Agrobacterium 이용 형질전환을 시도하였다. Hygromycin 저항성을 이용한 선발 결과, 대조군에서는 균사체 생육이 전혀 관찰되지 않은 반면 물리적 상해군에서는 형질전환균사체 생육이 확인되었다. Genomic DNA PCR에 의한 유전자 도입을 확인함으로써 팽이균사체에 대한 매우 간편한 형질전환법을 제시할 수 있었다.
콩의 배당체 isoflavone류를 생리 활성형 aglycone으로 전환율을 증진시켜 콩 발효식품의 기능성을 증진시키고자, 식용버섯 균사체와 청국장 발효균 B. megateriw SMY-212를 이용하여 단독과 2단계 배양한 발효대두의 메탄올 추출물에 대한 항산화능과 인체 전립선암과 자궁암 세포주의 성장억제 효과를 조사하였다. 2단 발효대두 추출물의 수소공여능 효과는 1,000 $\mu$g/mL 농도에서 17.8∼26.9%로서 단독 발효대두보다 30∼40% 높았으며, 그 중에 동충하초와 SMY-212를 배양한 것이 가장 높았다. Linoleic acid에 대한 항산화 효과는 단독 발효대두는 동충하초가 가장 높았으며, 2단계 배양한 발효대두는 팽이균사체와 SMY-212가 오히려 높게 나타났다. 인체 전립선암 세포주(DU145)와 자궁암 세포주(Hela)에 대한 성장억제 효과는 단독배양에 서 모두 팽이버섯 균사체를 이용한 발효대두가 가장 높았으며, 2단계 배양에서 DU145에서는 팽이버섯과 아가리쿠스 균사체 배양물에 SMY-212를 이용한 발효대두가 높았고, HeLa에서는 팽이버섯, 동충하초, 새 송이버섯 균사체의 추출물 순으로 높았다. 결론적으로 삶은 콩에 버섯 균사체의 단독배양보다는 버섯균사체와 SMY-212를 2단 배양한 발효대두 추출물이 암세포주 성장억제 효과가 높게 나타났다.
팽이균사체의 형질전환을 위하여 Agrobacterium 세포를 사용하였다. 특히, Agrobacterium 세포의 감염단계 전에 약한 NaOH용액을 처리하였으며 이로써 균사체 세포들의 표면 상해 발생을 기대하였다. 그 결과, hygromycin 저항성 ($hyg^r$) 균사체는 NaOH 처리를 거친 경우에서만 출현하였다. 형질전환 균사체의 $hyg^r$ 유전자 도입은 PCR로 확인되었으며 또한 Southern blot hybridization과 western blotting 분석에 의하여 단일 유전자 copy의 삽입과 외래유전자의 발현을 확인할 수 있었다. 본 연구는 팽이균사체에 대한 효율적인 Agrobacterium 이용 형질전환수단을 보여주고 있다.
일반성분 중 조회분 함량은 버섯이 균사체 보다 높은 조회분 함량을 보였다. 조단백질은 모든 시험구에서 19% 내외로 나타났고, 조지방 함량은 동충하초 균사체에서 가장 높았으며, 조섬유는 팽이버섯에서 가장 높게 나타났다. 가용성물질소물은 팽이버섯균사체와 동충하초균사체에서 60% 이상의 함량을 나타내었다. 각 시료별 총단백질과 총당의 구성 비율은 팽이버섯과 팽이버섯 균사체의 단백다당류의 구성이 다름을 확인하였다. 시료별 핵산관련물질 함량은 팽이버섯에서 5'-GMP, 5'-XMP, 5'-IMP순으로 높게 나타났고, 팽이버섯 균사체는 5'-XMP, 5'-GMP, 5'-IMP, 동충하초 균사체는 5'-XMP, 5'-IMP, 5'-GMP순으로 높게 나타났다. 모든시료에서 각각 17종의 아미노산이 검출되었다. 각 시료의 총 아미노산 함량을 살펴보면 팽이버섯 18,980 mg%, 팽이버섯 균사체 17,604 mg%, 동충하초 균사체 18,429 mg%로 나타났고 모든 시료에서 glutamic acid 함량이 가장 높았다. 유리아미노산 함량도 구성아미노산과 유사하게 팽이버섯, 팽이버섯 균사체, 동충하초 균사체 순으로 높게 나타났다. 본 실험결과 팽이버섯, 팽이버섯 균사체 및 동충하초 균사체는 핵산관련 물질과 아미노산 함량이 높게 나타나, 아미노산 함유 식품 개발에 적합한 자원으로 활용도가 기대된다.
한국산 복령과 후박의 이용성 확대를 위하여 각각 추출물의 ABTS와 DPPH라디칼의 소거능, 환원력의 항산화능 효과 및 인체암 세포주의 항암활성에 대하여 조사하였다. 복령과 후박을 버섯균사체로 발효시킨 한약 추출액의 항산화활성(ABTS와 DPPH 라디칼소거, 환원력)은 시료 추출물의 농도가 증가할수록 비례적으로 증가하였으며, DPPH 라디칼 소거활성은 ABTS보다 비교적 높게 나타났고, 원료후박 추출물($21.16{\sim}24.68%$)은 원료복령 추출물($45.46{\sim}49.63%$)에 비하여 약 2배 이상 높았다. 복령 시료 추출물의 농도별에 따른 환원력은 원료 복령($0.55{\sim}0.63$)에 비하여 동충하초, 팽이버섯 및 큰 느타리 균사체로 발효시킨 시료($0.50{\sim}0.62$)의 흡광도로 서로 비슷한 증가를 나타내었고, 후박 시료 추출물의 농도별에 따른 환원력은 원료 후박 추출물($0.98{\sim}1.06$)이 3가지의 버섯 균사체 발효후박 추출물($0.76{\sim}1.01$)에 비하여 약간 높았다. 자궁경부암세포(HeLa)와 대장암세포(HT-29)는 원료복령과 후박의 추출물이 각각의 발효한약에 비하여 저해활성이 높았다. 간암세포(HepG2)는 $200{\mu}g/assay$ 농도에서 팽이버섯 균사체 발효복령의 추출물이 가장 높았는데, 원료복령과 동충하초 및 큰 느타리에 비하여 각각 1.79, 1.35, 1.03배 높은 저해활성을 나타내었다. 그리고 팽이버섯과 동충하초 균사체를 배양한 발효후박에서 각각 $11.39{\sim}53.92%$, $10.71{\sim}50.21%$ 범위였으며, 원료후박에 비하여 $200{\mu}g/assay$ 농도에서 각각 2.21배, 2.05배 높은 저해활성을 나타내었다. 유방암세포(MCF-7)는 발효복령 추출물의 저해활성이 팽이버섯 균사체($58.35{\sim}72.87%$)에서 가장 높았으며, 큰 느타리버섯($61.04{\sim}67.66%$)과 동충하초($39.74{\sim}66.40%$) 및 원료복령($50.32{\sim}69.24%$)은 서로 비슷하였다.
팽이버섯 균사체를 액체배양하여 전통 장류 발효식품및 음료개발에 이용할 목적으로 7종류의 곡물에 배양한 팽이버섯 배양액의 생리활성을 검토하였다 혈전 용해능은 골목 배양액과 침전물사이에는 차이가 없었으며, 대체로 조, 대두박 및 검정콩 배지에서 혈전용해능이 높게 나타났다. 항균력은 S.aureus에 대해서는 밀, 보리 및 검정콩이 높았고, L. plantarum에 대해서는 조, 밀 및 보리가 높았으며, E.coli에 대해서는 밀과 보리 배지에서 배양한 배양액이 높게 나타났다. Linoleic acid에 대한 항산화 효과는 곡물배지 자체에서는 검정콩, 대두박 및 합성배지에서 높게 나타났고, 팽이버섯을 배양했을 때는 검정콩배지의 항산화력과 유사한 활성을 나타내었다. 비장세포의 증식능은 보리, 밀, 조 및 합성배지에 팽이버섯을 배양하였을 때가 곡물자체에서보다 약 20% 정도 높게 나타났다. ConA를 버섯배양 추출물에 혼합했을 때는 옥수수, 대두박 및 검정콩에서 팽이버섯을 배양한 배양액이 $22\sim26%$ 정도의 증식효과가 있었으며, LPS를 혼합했을 경우는 옥수수, 대두박, 검정콩배지에 배양한 배양액이 각각 45%, 25%,18%의 증식효과가 나타내었다.
버섯류에 세균병을 유발시키는 Pseudomonas agarici와 P. tolaasii가 팽이버섯균의 균사생장 및 자실체형성에 미치는 영향을 알아보기 위해 접종시기와 접종농도를 달리하여 기내에서 조사하였다. 팽이버섯균과 병원세균을 동시에 접종하거나 팽이버섯균접종 5일후에 병원세균을 접종했을 때 병원세균의 접종농도가 높아짐에 따라 균사생장과 자실체 형성이 현저하게 억제되는 경향이었으며, 특히 $10^2{\sim}10^6\;cfu/g$ media의 접종농도에서 균사생장이 지연되면서 엷음 또는 흐림증상을 보였고 $10^8\;cfu/g$ media농도에서는 특정분위에서부터 균사가 더이상 진전되지 못하는 멈춤증상을 나타냈다. 그리고 P. agarici $10^2\;cfu/g$ media 이상의 농도와 P. tolaasii $10^4\;cfu/g$ media 이상의 농도에서는 자실체의 수확을 전혀 기대할 수 없었다. 두 병원세균 사이의 팽이버섯균에 대한 균사생장억제력은 P. agarici에 비해 P. tolaasii가 다소 높았으며, 자실체형성억제력은 P. tolaasii 비해 P. agarici가 다소 높은 결과를 보였다. 그러나 팽이버섯균접종 10일후 병원세균을 접종한 경우 두 병원세균 모두가 균사생장과 자실체생육에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
본 연구에서는 담자균 균사체를 황기에 배양하여 이용성 및 기능성을 증진시킨 식품 및 소재를 개발하기 위한 연구의 일환으로 기초연구를 실시하였다. 수분함량, pH 및 환원당을 측정함으로서 균사체 배양 황기의 변화를 관찰한 결과 수분함량은 대조구에 비하여 전체적으로 증가하였으며, pH는 상황버섯 균사체 및 팽이버섯 균사체 배양 황기의 pH가 각각 6.51, 6.41로 증가하는 경향을 보였으나, 이 외의 균사체가 배양된 황기는 대조구와 유사한 수치인 pH 5.30~5.61로 미미하거나 특별한 변화폭을 보이지 않았다. 환원당 함량 측정결과 팽이버섯 균사체 배양 황기가 대조구에 비해 약 2배 증가한 391.74 mg/100 g으로 가장 높은 함량을 나타냈고, 다음으로 상황버섯 및 큰 느타리버섯 균사체 배양 황기가 각각 346.73 mg/100 g 및 289.97 mg/100 g으로 다소 증가한 함량을 나타냈다. 추출용매에 따른 균사체 배양 황기의 추출수율 결과 열수추출물이 80% 에탄올 추출물 보다 높았으며, 큰 느타리버섯 균사체 배양 황기의 열수추출물이 52%로 가장 높은 수율을 나타내었다. 유리당 함량 분석결과 80% 에탄올 추출물에서 fructose는 큰 느타리버섯 균사체 배양 황기의 함량이 2,154.61 mg/100 g으로 가장 높았고, sucrose는 표고버섯 균사체 배양 황기가 8,929.60 mg/100 g 으로 가장 높은 함량을 보였으며, glucose는 모든 실험구에서 감소되거나 검출되지 않았다. 열수추출물에서 fructose는 1,528.03 mg/100 g으로 큰 느타리버섯 균사체 배양 황기가 가장 높은 함량을 나타낸 반면 glucose 및 sucrose는 전반적으로 감소되거나 검출되지 않았다. 그러나 대조구 자체에서 검출되지 않았던 glucose가 상황버섯 균사체 배양 황기에서 1,547.51 mg/100 g의 높은 함량으로 검출되었다. 담자균 배양 황기의 성분 함량을 분석한 결과 80% 에탄올 추출물에서 상황버섯(calycosin 2,549.24 mg/g, formononetin 1,366.69 mg/g) > 팽이버섯(calycosin 983.57 mg/g, formononetin 744.14 mg/g) > 표고버섯(calycosin 788.29 mg/g, formononetin 621.22 mg/g) 순으로 함량이 크게 증가하였고, 열수추출물에서는 상황버섯(calycosin 827.66 mg/g, formononetin 221.28 mg/g) > 표고버섯(calycosin 349.45 mg/g, formononetin 142.35 mg/g) > 팽이버섯(calycosin 328.36 mg/g, formononetin 127.64 mg/g) 순으로 높은 함량은 나타내었다. 이러한 결과는 담자균의 효소활성으로 인해 황기의 배당체 성분이 aglycon형태로 전환됨으로서 calycosin 및 formononetin 함량이 증가한 것으로 사료된다. 본 연구에서 담자균 균사체 배양을 통해 황기의 기능성을 증대 시킬 수 있음을 알 수 있었고, 이러한 담자균이 배양된 황기를 이용하여 기능성 및 생리활성 효능 등이 증대된 식품소재 및 건강기능식품으로 개발 가능성이 있음을 제시하였다. 따라서 본 연구결과를 기초자료로 하여 황기의 기능성을 증대시키기에 적합한 담자균을 이용하여 배양일에 따른 황기의 이화학적 특성 및 성분분석과 더불어 세포실험 등을 통해 기대되는 생리활성 효능에 대한 검증이 필요할 것으로 생각된다.
갈색 팽이균주간의 유전적 특성을 보기 위하여 RAPD를 수행하여 유전적 계통도를 본 결과 85% 수준에서 5개의 그룹으로 구분되었다. 생리적 특성으로는 최적 온도는 $25^{\circ}C$이고, CBFM-002를 제외한 모든 균주가 pH 6.0~7.0 범위에서 균사 생장이 양호하였다. 균사생장은 MCM 배지에서 68.4~83.4 mm로 가장 좋았고 균사밀도는 WA배지를 제외한 모든 배지에서 균사밀도가 높았다. 균총과 자실체 간의 색깔 간에는 일정한 경향을 찾을 수 없었다. 갈색팽이버섯 재배에 적당한 배지 재료를 선발하기 위하여 검토한 결과, 배지별 이화학적 성분 분석에서 T-N은 미송+면실박+비트펄프 (6:2:2)가 가장 많았고, $P_2O_2$, $K_2O$, MgO는 미송+쌀겨(8:2)배지에서 가장 많이 함유되어 있었다. 배지혼용 처리에 따른 균사생장 정도는 CBFM-003, CBFM-007균주 모두 미송+면실박+비트펄프 (6:2:2) 배지에서 균사생장이 빠르고 균사밀도가 높았다. 혼용된 배지로 병재배시 자실체의 갓 직경, 대 직경, 대 길이는 CBFM-003, CBFM-007 균주는 모든 배지에서 비슷한 경향을 보였다. 병버섯 재배에서 배지 혼합비율에 따른 균주간 균사 및 자실체의 생육은 미송+쌀겨 (8:2)보다 미송+면실박+비트펄프 (6:2:2)배지에서 CBFM-003은 156.3 g, CBFM-007은 162.8 g으로 가장 좋은 수량을 보였다. 병재배에서 생육온도에 따른 수량은 $7^{\circ}C$에서 약간 높은 수량을 보였으나, 발이기간 동안 에너지 투입량 등 경제성을 고려하면 CBFM-007은 발이온도 $10^{\circ}C$가 적합한 것으로 판단되었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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